Development and application of the human cytochrome P450 monooxygenase 3A4 for preparative scale biocatalysis of valuable pharmaceutical compounds

Srdic, Matic; Schwaneberg, Ulrich; Elling, Lothar

doi:10.18154/RWTH-2025-02940

Development and application of the human cytochrome P450 monooxygenase 3A4 for preparative scale biocatalysis of valuable pharmaceutical compounds

Srdic, Matic^RWTH*

2024 & 2025

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Matic Srdič M. Sc. molecular and functional biology

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2024

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2024

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2025

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)^RWTH* ; Elling, Lothar (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2024-12-02

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2025-02940
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/1008313/files/1008313.pdf

Einrichtungen

Projekte

OXYTRAIN - Harnessing the power of enzymatic oxygen activation (722390) (722390)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
CYP3A4 (frei) ; Komagataella phaffii (frei) ; P450 (frei) ; PAHs (frei) ; Pichia pastoris (frei) ; bioreactor (frei) ; biotechnology (frei) ; fermentation (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Cytochrome P450 (CYPs) stellen eine essenzielle Gruppe von Enzymen dar, die in allen Reichen des Lebens vorkommen und primär als Monooxygenasen fungieren, wobei sie Hydroxylgruppen in diverse Substrate inkorporieren, um Xenobiotika zu detoxifizieren oder als Teil eines Syntheseweges zu dienen. Beim Menschen sind sie vornehmlich für den Metabolismus von Arzneistoffen oder anderen Xenobiotika sowie für die Synthese essenzieller Verbindungen wie Steroidhormonen bekannt. Ihre genetische Diversität und einzigartige Oxygenierungsfähigkeit machen sie zu interessanten Zielstrukturen für die biotechnologische Forschung. In diesem Kontext werden sie besonders für die große Vielfalt akzeptierter Substrate sowie für ihre außergewöhnliche Regio- und Stereoselektivität bei der Produktion wertvoller Verbindungen wie Arzneistoffe oder Feinchemikalien geschätzt. Als bedeutende Mediatoren des Arzneistoffmetabolismus und der Arzneistoffelimination werden sie routinemäßig in Metabolitenidentifikationsstudien (MetID) und bei Sicherheitsprüfungen von Metaboliten (MIST) eingesetzt. Einer der Gründe für die hohen Kosten bei der Markteinführung eines Arzneimittels ist die hohe Ausfallrate potenzieller Wirkstoffkandidaten aufgrund von Sicherheitsbedenken oder der Unfähigkeit, bei sicheren Dosierungen wirksam zu sein. Die Entwicklung eines neuartigen Biokatalysators basierend auf dem humanen CYP3A4, dem Enzym, das am Metabolismus von über 50% aller von der FDA zugelassenen Arzneimittel beteiligt ist, würde zur Lösung eines wichtigen Problems beitragen und einen erheblichen Nutzen für die frühe Arzneimittelprüfung darstellen. Daher konzentrierte sich der erste Teil dieser Dissertation auf die Verbesserung der Expression des humanen CYP3A4-Enzyms in der Hefe Komagataella phaffii (Pichia pastoris), mit dem Ziel, einen neuartigen kosteneffizienten Biokatalysator für die Arzneimittelmetabolismusforschung anzubieten. Idealerweise sollte dieser Biokatalysator in der Lage sein, nachweisbare Mengen weniger abundanter Metaboliten zu produzieren, die in frühen Entwicklungsphasen oft übersehen werden, bedingt durch die geringen Reaktionsvolumina und hohen Geschwindigkeiten, die in Hochdurchsatz-Screening-Systemen verwendet werden. Daher war eine hohe spezifische Aktivität des Biokatalysators, die sowohl nach der Produktion als auch während der Lagerung erhalten bleibt, für dieses Projekt von entscheidender Bedeutung. Von zentraler Bedeutung war auch die Inkorporation des CYP3A4-Enzyms und seines Redoxpartnerenzyms CPR in den K. phaffii BSYBG11-Stamm unter Verwendung innovativer bidirektionaler Promotoren für eine ausgewogene Proteinexpression. Dieser Ansatz milderte transkriptionelle Kollisionen und optimierte die Enzymproduktion. Die Entwicklung einer neuartigen spezialisierten Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (HPLC-MS)-Methode war notwendig für eine schnelle und präzise Metabolitentrennung und -quantifizierung, die die HTS-Methoden in der ADME-Forschung imitiert, um eine zuverlässige Bewertung und Screening des entwickelten Biokatalysators zu ermöglichen. Wir wählten Testosteron als Modellsubstrat für das Enzym und für die Entwicklung der HPLC-MS-Methode, da es das Standardsubstrat in der CYP3A4-Forschung ist und zu einer Vielzahl von Produkten biotransformiert wird. Die entwickelte Screening-Methode trennte effizient Testosteron und seine Hydroxylierungsprodukte. Die Forschung untersuchte auch die Auswirkungen von Lagerungsbedingungen auf die Enzymaktivität und kam zu dem Schluss, dass das Einfrieren von Zellen in Puffer bei -80°C am effektivsten war, wobei die Lyophilisierung Handhabungsvorteile bei höheren Temperaturen bot. Der entwickelte neuartige Biokatalysator hat bereits zur Entdeckung bisher nicht detektierter Testosteronmetaboliten beigetragen, die mittels NMR verifiziert wurden, wie 6-Dehydro-15β-hydroxytestosteron und 6β,16β-Dihydroxytestosteron, wie in einer Studie von Fessner et al. berichtet. Der zweite Teil der Dissertation wurde konzipiert, um den generierten CYP3A4-Biokatalysator für eine Proof-of-Concept-industrielle Anwendung zu nutzen, beginnend mit dem Screening polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (PAKs), um neuartige, durch humanes CYP3A4 gebildete Metaboliten zu finden, und später zur Pilotmaßstab-Funktionalisierung fortzuschreiten. PAKs sind bedeutende Umweltschadstoffe und attraktive Bausteine für die Synthese von Pharmazeutika und Feinchemikalien. CYPs können PAKs mittels C-H-Aktivierung funktionalisieren, ein Prozess, den wir durch enzymatische Biokonversion von PAKs und ihren N- und O-haltigen Derivaten unter Verwendung des im ersten Teil der Dissertation entwickelten Biokatalysators weiter aufklären wollten. Diese Arbeit berichtet über das erste Screening von PAKs durch humanes CYP3A4 und die erste Maßstabsvergrößerungsstudie einer PAK-Funktionalisierungsreaktion durch CYP3A4. Die Ergebnisse des Screenings lieferten empirische Belege für die Substratpräferenz gegenüber PAKs mittleren und hohen Molekulargewichts, was im Einklang mit der gut belegten Beschreibung von CYP3A4 als Enzym steht, das hauptsächlich große Substrate aufgrund seines großen aktiven Zentrums akzeptiert. Um die Robustheit der biokatalytischen Reaktion weiter zu untersuchen, skalierten wir die Reaktion auf einen 10-L-Edelstahlfermenter. Wir wählten Fluoren als unser Modellsubstrat aufgrund seiner weitverbreiteten Präsenz in einer Vielzahl von Naturstoffen und als Untersuchung einer potenziellen biokatalytischen Kaskadenreaktion. Unter Verwendung von Standard-unoptimierter Kultivierungsbedingungen erzielten wir 237 mg Fluorenol und 48 mg Fluorenon aus 498 mg Fluoren. Unsere kombinierte Biokonversionsausbeute betrug daher 57% mit einer Spitzenproduktivität von 27,7 μmol/L/h für Fluorenol und 5,9 μmol/L/h für Fluorenon. Diese Aktivitäten bestätigen, dass der neuartige CYP3A4-Ganzzell-Biokatalysator ein exzellenter Biokatalysator für die Produktion hochwertiger pharmazeutischer Verbindungen ist. Da unser experimentelles Design nur die am weitesten verbreiteten Bioreaktor-Bedingungen nutzte, sind weitere Optimierungen absehbar. Nichtsdestotrotz war dies eine Demonstration der Robustheit und Skalierbarkeit dieses Biokatalysators von einem 96-Well- bis zu einem 10-L-präparativen Maßstab und validiert das wissenschaftliche und Kommerzialisierungspotenzial des Systems.

Cytochromes P450 (CYPs) are a vital group of enzymes found in all the kingdoms of life where they primarily function as monooxygenases, incorporating hydroxyl groups into a variety of substrates to detoxify xenobiotics or as part of a synthetic pathway. In humans they are best known for metabolizing drugs or other xenobiotics and synthesizing essential compounds like steroid hormones. Their genetic diversity and unique oxygenation capability make them interesting targets for biotechnological research. Here they are particularly prized for both the wide variety of accepted substrates and capability for exceptional regio- and stereoselectivity in production of valuable compounds such as drugs or fine chemicals. As important mediators of drug metabolism and clearance they are routinely utilized in metabolite identification (MetID) studies and metabolite in safety testing (MIST). One of the reasons for the high cost of bringing a drug to market is the high attrition rate of potential drug candidates due to drug safety failures or its inability to be effective at safe doses. Developing a novel biocatalyst based on the human CYP3A4, the enzyme involved in the metabolism of over 50% of all FDA approved drugs, would assist in solving an important problem and be of considerable benefit to early drug testing. Therefore, the first part of this thesis focused on enhancing the expression of the human CYP3A4 enzyme in the yeast Komagataella phaffii (Pichia pastoris), with the goal of offering a novel cost-effective biocatalyst for drug metabolism research. Ideally this biocatalyst would be able to produce detectable amount of less abundant metabolites that are often missed in early development, due to the low reaction volumes and high speeds used in high-throughput screening systems, therefore a high specific activity of the biocatalyst that was retained after both production and storage was critical for this project. Central was also the incorporation of the CYP3A4 enzyme and its redox partner enzyme CPR into the K. phaffii BSYBG11 strain, using innovative bidirectional promoters for balanced protein expression. This approach mitigated transcriptional collisions, optimizing enzyme production. The development of a novel specialized high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS) method was necessary for rapid and accurate metabolite separation and quantification in a way that mimics the HTS methods used in ADME research, to enable faithful assessment and screening of the developed biocatalyst. We chose testosterone as the model substrate for the enzyme, and the development of the HPLC-MS method, due to it being the standard substrate used in CYP3A4 research as it is biotransformed into a number of products. The developed screening method efficiently separated testosterone and its hydroxylation products. The research also explored storage conditions' effects on enzyme activity, concluding that freezing cells in buffer at -80°C was most effective, with lyophilization providing handling convenience at higher temperatures. The developed novel biocatalyst has already contributed to discovering never before detected testosterone metabolites, verified by NMR, such as 6-dehydro-15β-hydroxytestosterone and 6β,16β-dihydroxytestosterone as reported in a study by Fessner et al. The second part of the thesis was designed to leverage the generated CYP3A4 biocatalyst for a proof-of-concept industrial application, starting by screening polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) to find novel metabolites formed by human CYP3A4 and later progress to their pilot scale functionalization. PAHs are important environmental pollutants and appealing building blocks for synthesizing pharmaceuticals and fine chemicals. CYPs can functionalize PAHs via C-H activation, a process which we hoped to elucidate further by enzymatic bioconversion of PAHs and their N- and O- containing derivatives using the biocatalyst developed in the first part of the thesis. This work reports the first screening of PAHs by human CYP3A4 and the first scale-up study of a PAH functionalization reaction by CYP3A4. The results of the screening provided the empirical evidence for substrate preference towards medium and high molecular weight PAHs, which falls in line with the well supported description of CYP3A4 as an enzyme that accepts mainly large substrates due to its large active site. To further explore the robustness of the biocatalytic reaction we scaled up the reaction to a 10 L stainless steel fermenter, we chose fluorene as our model substrate due to its widespread presence in a variety of natural products and as an investigation of a potential biocatalytic cascade reaction. Using standard unoptimized cultivation conditions we yielded 237 mg of fluorenol and 48 mg of fluorenone from 498 mg of fluorene. Our combined bioconversion yield was therefore 57% with a peak productivity of 27.7 μmol/L/h for fluorenol and 5.9 μmol/L/h for fluorenone, these activities confirm that the novel CYP3A4 whole cell biocatalyst is an excellent biocatalyst for producing high-value pharmaceutical compounds. As our experimental design utilized only the most widely used bioreactor conditions further optimizations are foreseeable. Nevertheless, this was a demonstration of robustness and scalability of this biocatalyst from a 96-well to a 10 L preparative scale and validates the systems scientific and commercialization potential.

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