Characterization of HyNaCs - peptide gated DEG/ENaCs from Hydra magnipapillata

Dürrnagel, Stefan Johannes; Gründer, Stefan

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-45969

Characterization of HyNaCs - peptide gated DEG/ENaCs from Hydra magnipapillata = Charakterisierung der HyNaCs : peptidaktivierte DEG/ENaC Ionenkanäle aus Hydra magnipapillata

Dürrnagel, Stefan Johannes

2013

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Stefan Johannes Dürrnagel

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2013

UmfangIII, 99 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2013

Zsfassung in dt. und engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Gründer, Stefan (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2013-05-28

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-45969
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/210372/files/4596.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Physiologie (512000-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Ionenkanal (Genormte SW) ; Hydra <Polyp> (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; FaNaC (frei) ; DEG/ENaC (frei) ; ligandgesteuert (frei) ; ion channel (frei) ; Hydra (frei) ; gating (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die DEG/ENaC Ionenkanalfamilie umfasst eine Gruppe phylogenetisch verwandter Ionenkanäle, die in nahezu allen vielzelligen Tieren (Metazoen) zu finden sind. Ein charakteristisches Merkmal aller DEG/ENaC Kanäle ist ihre Selektivität für Natrium sowie die Sensitivität gegenüber dem Inhibitor Amilorid. Neben diesen Gemeinsamkeiten bilden die einzelnen Vertreter der DEG/ENaC Familie hinsichtlich ihrer Expressionsmuster, ihrer Aktivierungsmechanismen und ihrer physiologischen Funktion eine sehr heterogene Gruppe. So sind beispielsweise die durch Protonen aktivierten ASICs an der Schmerzwahrnehmung beteiligt; ENaC vermittelt als konstitutiv geöffneter Kanal die Natriumresorption über Epithelien und FaNaC ist der erste beschriebene Ionenkanal, der durch endogene Neuropeptide aktiviert wird. Um ein besseres Verständnis grundlegender Eigenschaften dieser heterogenen Kanalfamilie zu erhalten und ursprüngliche Funktionsweisen der Kanalfamilie zu erforschen wurden durch unsere Arbeitsgruppe neue DEG/ENaC Untereinheiten aus dem Süßwasserpolypen Hydra magnipapillata kloniert. Hydra gehört zum Phylum Cnidaria, dem evolutionär ältesten Tierstamm in dem sich ein Nervensystem entwickelte. Die Beschreibung der Eigenschaften von DEG/ENaC Kanälen aus Hydra kann somit wichtige Impulse für die Erforschung grundlegender Mechanismen aller DEG/ENaC Kanäle liefern. Bisher wurden von unserer Gruppe vier neue DEG/ENaC Untereinheiten aus Hydra kloniert und HyNaC1-4 genannt. In einer früheren Arbeit konnte bereits gezeigt werden, dass die Untereinheiten HyNaC2 und -3 einen funktionellen Ionenkanal bilden, der durch endogene Neuropeptide aus Hydra, die HydraRFamide I und II, direkt aktiviert wird. Bis heute sind HyNaCs und der verwandte FMRFamide-gated sodium channel (FaNaC) die einzigen bekannten peptidaktivierten Ionenkanäle. In dieser Arbeit wurde HyNaC5, eine weitere DEG/ENaC Untereinheit aus Hydra, untersucht. Wird HyNaC5 zusammen mit HyNaC2 und -3 exprimiert, so erhöhte sich die apparente Affinität für die HydraRFamide I und II etwa 100-fach. Zudem zeigte HyNaC2/3/5 im Vergleich zu HyNaC2/3 eine erhöhte Selektivität für Natrium und war stärker durch den Inhibitor Amilorid blockierbar. Zusammenfassend belegen diese Ergebnisse, dass die Untereinheiten HyNaC2, -3 und -5 gemeinsam einen heterotrimeren, peptidaktivierten Ionenkanal bilden. Die nach Koexpression von HyNaC5 vergrößerten Stromamplituden, die erhöhte Affinität für die HydraRFamide sowie die größere Sensitivität für Amilorid deuten zudem darauf hin, dass es sich bei HyNaC2/3/5 und nicht bei HyNaC2/3 um die in Hydra physiologisch relevante Kanalform handelt. In zweiten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass HyNaC2/3/5 stark permeabel für Kalzium ist. Dieses Ergebnis ist überraschend, da alle bekannten DEG/ENaCs keine oder nur geringe Leitfähigkeit für Kalzium besitzen und Natriumselektivität ein vereinendes und namensgebendes Merkmal der DEG/ENaC Ionenkanalfamilie ist. Die ermittelte Kalziumpermeabilität (PCa/PNa ungefähr gleich 3.8) zeigt, dass HyNaC2/3/5 in die Gruppe stark kalziumpermeabler Ionenkanäle einzuordnen ist. In Xenopus Oozyten führte der Kalziuminflux durch HyNaC2/3/5 zur Aktivierung endogen exprimierter, kalziumabhängiger Chloridkanäle (CaCCs), die den Kalziumeinstrom direkt anzeigten. Durch den Block der CaCCs konnte die einfache, treppenförmige und nicht desensitisierende Stromcharakteristik von HyNaC2/3/5 aufgeklärt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass HyNaC2/3/5 zusätzlich durch Kalzium blockiert wird. Der Block war spannungsabhängig und verstärkte sich bei positiven Potentialen. Es zeigte sich, dass ein konserviertes Aspartat kurz vor dem extrazellulären Poreneingang sowohl für die Kalziumleitfähigkeit als auch für den Kalziumblock von HyNaC2/3/5 essentiell ist. Der Austausch dieser Aminosäure führte zu stark verminderter Kalziumleitfähigkeit und einer Verringerung des spannungsabhängigen Kalziumblocks. Durch eine in situ Hybridisierung wurde die Expression von hynac2, -3 und -5 an der Tentakelbasis von Hydra nachgewiesen werden. Dieses Expressionsmuster überlappt mit der Expression der HydraRFamide I und II. Daher könnten HyNaCs, eventuell vermittelt durch deren Kalziumleitfähigkeit, eine wichtige Funktion bei der Koordination der Tentakelbewegung während der Nahrungsaufnahme spielen. Tatsächlich konnten wir zeigen, dass die durch Glutathion induzierte „feeding reaction“ in Hydra durch Applikation des DEG/ENaC Inhibitors Amilorid verlangsamt wird. Die Entdeckung eines DEG/ENaC Kanals mit hoher Kalziumleitfähigkeit aus Hydra weist zudem darauf hin, dass Natriumselektivität bei dem gemeinsamen Vorläufer der Kanalfamilie möglicherweise noch nicht ausgeprägt war, sondern sich in der Evolution später entwickelte.

The DEG/ENaC ion channel family comprises a group of phylogenetically related ion channels found in almost all multicellullar animals (metazoa). Common characteristics of DEG/ENaCs are their selectivity for Na+ and their sensitivity for the inhibitor amiloride. Besides these shared features, the individual DEG/ENaCs display a huge diversity with regard to their expression pattern, stimulus of activation and their physiological function. For example, ASICs are proton-gated channels implied in the perception of pain while ENaCs are constitutively active and facilitate sodium reabsorption across epithelia and FaNaC is the first identified ion channel directly gated by neuropeptides. To obtain a better understanding of the basic properties of this heterogeneous group of ion channels, our group has cloned novel DEG/ENaC subunits from the freshwater polyp Hydra magnipapillata. Hydra belongs to the phylum Cnidaria, which is considered as the most ancient phylum in which a nervous system has evolved. Therefore, the characterisation of DEG/ENaC channels from Hydra will help to identify principal and basic properties, which are shared by all DEG/ENaC members. So far, our group has cloned four DEG/ENaC subunits from Hydra, which were named HyNaC1-4. It was already shown that coinjection of the subunits HyNaC2 and -3 leads to expression of a functional ion channel in Xenopus oocytes that is directly gated by endogenous neuropeptides from Hydra, the HydraRFamides I and II. To date, HyNaCs and related FMRFamide-gated sodium channels (FaNaCs) are the only known peptide-gated ion channels. In this work HyNaC5, a novel DEG/ENaC subunit from Hydra, was investigated. When HyNaC5 was coexpressed together with HyNaC2 and -3, the apparent affinity for the HydraRFamides I and II was increased approximately equal 100-fold. In addition, HyNaC2/3/5 exhibited an increased selectivity for Na+ and was blocked more potently by the inhibitor amiloride than HyNaC2/3. In summary, the results confirm that the subunits HyNaC2, -3, and -5 together form a heterotrimeric, peptide-gated ion channel. Moreover, the increased current amplitudes, the increased apparent affinity for the HydraRFamides and the enhanced sensitivity for the inhibitor amiloride collectively suggest that the ion channel consisting of HyNaC2/3/5 and not HyNaC2/3 is the physiologically relevant channel in Hydra. In the second part of this thesis it was shown that the channel formed by HyNaC2/3/5 is also highly permeably for Ca2+. This finding is surprising, as all known DEG/ENaCs are Ca2+ impermeable or conduct Ca2+ only to a minor extend. Indeed, selectivity for Na+ is a common and name giving feature of DEG/ENaCs. We estimated a relative Ca2+ permeability (PCa/PNa) of approximately equal to 3.8, which places HyNaC2/3/5 into the group of highly Ca2+ conductive channels. In Xenopus oocytes, the influx of Ca2+ through HyNaCs was directly visible by secondary activation of endogenously expressed calcium activated chloride channels (CaCCs). The block of CaCCs revealed the simple, step-like and non-desensitizising current characteristic of HyNaC2/3/5. Moreover, it was shown that Ca2+ also blocks HyNaC2/3/5. The block was voltage-dependent and increased at more positive potentials. Furthermore, a conserved aspartate residue situated at the outer entrance of the ion pore that is essential for both, the high Ca2+ permeability and the Ca2+ block of HyNaC2/3/5 was identified. Substitution of this residue led to a strong reduction of Ca2+ permeability and reduced voltage dependent Ca2+ block. By an in situ hybridisation assay, the expression pattern of hynac2, -3, and -5 was localized at the base of the tentacles in Hydra. The expression overlapped with the previously reported expression of the HydraRFamides I and II. We therefore speculate that HyNaCs – possibly mediated by their permeability for Ca2+ – might play a role in the coordinated movement of the tentacles during feeding in Hydra. Indeed, we could show that application of amiloride, a universal inhibitor of DEG/ENaCs, delays the glutathione induced feeding reaction in Hydra. In addition, the identification of a novel DEG/ENaC with high permeability for Ca2+ from Hydra suggest that selectivity for Na+ was not shared by the common ancestor of all DEG/ENaCs and arose later in evolution.

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