A Leishmania ortholog of macrophage migration inhibitory factor modulates host macrophage responses

Kamir, Daniela; Bernhagen, Jürgen

doi:2516

A Leishmania ortholog of macrophage migration inhibitory factor modulates host macrophage responses = Ein Leishmania Ortholog des „Macrophage Migration Inhibitory Factor” reguliert Wirts-Makrophagenantworten

Kamir, Daniela (Author)

2008

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Daniela Kamir

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2008

UmfangGetr. Zählung : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Bernhagen, Jürgen (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2008-07-17

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-25165
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/50297/files/Kamir_Daniela.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Biochemie und Molekularbiologie (513000-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Makrophagen-Inhibitionsfaktor (Genormte SW) ; Leishmania major (Genormte SW) ; Makrophage (Genormte SW) ; Immunreaktion (Genormte SW) ; Protein p53 (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; immune evasion (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Parasitische Organismen haben Strategien entwickelt, um die Mechanismen der Wirts-Immunantwort zu umgehen. Diese Doktorarbeit beschreibt die Charakterisierung von zwei Leishmania major kodierten Orthologen des pro-inflammatorischen pleiotropischen Zytokins, macrophage migration inhibitory factor (MIF). Diese zwei MIF-ähnlichen Sequenzen sind bei der Durchführung eines Alignments zu 22% identisch mit humanem MIF und sind höchstwahrscheinlich durch Genduplikation entstanden. Die Lm1740MIF und Lm1750MIF Gene (58% identisch) werden in allen Entwicklungsstadien von L. major exprimiert. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass die Expressionslevel im prozyklischen Lebensstadium des Parasiten signifikant hochreguliert sind, welche nur in der Sandfliege, dem Wirt vorkommen. Desweiteren, waren die Lm1750MIF Level 3-4 mal höher als die von Lm1740MIF. Die Erkenntnis, dass LmMIF in prozyklischen Parasiten exprimiert wird, könnte eine neue Funktion von MIF innerhalb seines Überträgers, der Sandfliege, offenbaren. Ausserdem, postuliert die hier beschriebene Arbeit, dass Lm1740MIF mit dem Makrophagen-Oberflächenrezeptor CD74 interagiert. Um die Hypothese zu überprüfen, wurden Bindungsanalysen unter Verwendung von Oberflächenplasmonresonanz (Biacore) durchgeführt. Der Kd von MIF wurde vorher auf einen Wert zwischen 9 x 10-9 bis 2.3 x 10-10 geschätzt. Lm1740MIF zeigte eine signifikante Bindungsinteraktion mit CD74 (Kd = 2.9 x 10-8 M). Folglich, gibt es eine ausreichende strukturelle Homologie zwischen Lm1740MIF und humanem MIF, um eine Bindung mit hoher Affinität zu CD74 zuzulassen. Um zu ermitteln, ob Lm1740MIF die Aktivierung von ERK1/2 in Abhängigkeit von CD74 induziert und, um zu bestimmen, ob es zur Inhibierung von aktivierungsinduzierter Makrophagenapoptose kommt – sowie es bei mMIF der Fall ist-, wurde die Fähigkeit von Lm1740MIF die Phosphorylierung von ERK1/2 zu stimulieren, sowie die Ser15-Phosphorylierung des Tumorsuppressors p53 zu inhibieren, getestet. Makrophagen wurden mit Lm1740MIF behandelt, um die Apoptoserate mittels ELISA und die ERK1/2- und p53-Aktivierung mittels Western Blots bestimmen zu können. Die Interaktion zwischen Lm1740MIF und CD74 führte zu einer Signaltransduktionsantwort in sowohl aus Wildtyp als auch C3H/HeJ Mäusen gewonnenen Makrophagen – dies weist darauf hin, dass die Signalwirkung nicht auf kontaminierendes Endotoxin zurückzuführen ist. Lm1740MIF war sowohl in der ERK1/2-Signalwirkung als auch beim Schutz vor Apoptosis funktionell aktiv, obwohl der Aktivitätslevel im allgemeinen geringer war als für mammalisches MIF. Diese Beobachtung schien vereinbar mit dem geringeren Kd für die Interaktion von Lm1740MIF mit dem CD74-Rezeptor zu sein. Für Maus-MIF war der Schutz vor Apoptose abhängig von CD74, und die Immunantwort wurde mit einer Abnahme des cytoplasmatischen P-Ser15-p53 verbunden. Die Fähigkeit von Lm1740MIF Apoptose zu inhibieren, könnte zur Persistenz von Leishmania in den Makrophagen und zur immune evasion des Parasiten beitragen. Der genaue Mechanismus durch den Lm1740MIF CD74 aktiviert und, ob Lm1740MIF zusätzliche Signalwege anschaltet, die wichtig für intrazellulären Parasitismus oder für immune evasion sein könnten, muss noch bestimmt werden. Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass ein Leishmania Ortholog des Zytokins MIF die Fähigkeit hat, den humanen MIF Rezeptor zu aktivieren und die funktionellen Monozyten-/Makrophagen-Antworten zu beeinflussen. Da Leishmaniose eine intrazelluläre Infektion von Monozyten/Makrophagen ist, wird angenommen, dass der Erhalt von Monozyten/Makrophagen durch Leishmania kodiertes MIF unterstützt wird und somit zum Erhalt des Parasiten und dessen infektiösen Lebenszykluses beiträgt. Während diese Daten in Einklang mit Leishmania MIF’s Rolle in der Abwandlung von Wirts-Immunantworten sind, schliessen sie nicht aus, dass Lm1740MIF eine Funktion im Wachstum und/oder in der Replikation des Parasiten zukommt.

Parasitic organisms have evolved specialized strategies to evade host immune defense mechanisms. This thesis describes the characterization of two Leishmania major-encoded orthologs of the pro-inflammatory pleiotropic cytokine, macrophage migration inhibitory factor (MIF). These two MIF-like sequences show 22% sequence identity when aligned with human MIF, and are most likely the result of gene duplication. The Lm1740MIF and Lm1750MIF genes (58% identity) are expressed in all developmental stages of L. major. Interestingly, LmMIF expression levels were shown to be significantly up-regulated in the procyclic life-stage of the parasite, which exists solely in the host sand fly. Furthermore, Lm1750MIF levels were 3–4 fold higher than Lm1740MIF levels. The finding that LmMIF is expressed in procyclic parasites might reveal a new function for MIF within its vector, the sandfly. Furthermore, the work described here postulated that Lm1740MIF might interact with the macrophage surface receptor, CD74. To evaluate this hypothesis, binding analyses using surface plasmon resonance (Biacore) were carried out. The Kd of MIF was previously approximated to be between 9 × 10-9 to 2.3 × 10-10. Lm1740MIF showed a significant binding interaction with CD74 (Kd=2.9 × 10-8 M). Thus, there is sufficient structural homology between Lm1740MIF and human MIF to permit high-affinity binding to CD74. To investigate whether Lm1740MIF induces ERK1/2 activation in a CD74-dependent manner and to determine if it inhibits activation-induced macrophage apoptosis similar to its mammalian counterpart, the ability of Lm1740MIF to stimulate ERK1/2 phosphorylation as well as to inhibit Ser15 phosphorylation of the tumor suppressor p53 was tested. Macrophages treated with Lm1740MIF were assessed for apoptosis by the ELISA method; additionally, Western blot analyses for ERK1/2 and p53 activation were performed. The interaction between Lm1740MIF and CD74 led to an similar signal transduction response in macrophages obtained from both wild-type and C3H/HeJ mice, indicating that signaling was not due to the presence of contaminating endotoxin. Lm1740MIF was functionally active in both ERK1/2 signaling and protection from apoptosis, although the level of activity was generally lower than for mammalian MIF, an observation that appeared consistent with the lower Kd of Lm1740MIF for the CD74 receptor. For mouse MIF, protection from apoptosis was dependent on CD74, and the response was associated with a decrease in the cytoplasmic content of Ser15-phosphorylated p53. The ability of Lm1740MIF to inhibit apoptosis may facilitate the persistence of Leishmania within macrophages and contribute to its evasion from immune destruction. The precise cellular pathway by which Lm1740MIF activates CD74 and whether Lm1740MIF modulates additional pathways that are important for either intracellular parasitism or for immune evasion remains to be determined. In conclusion, the presented results indicate that a Leishmania ortholog of the cytokine MIF has the ability to activate the human MIF receptor and influence the functional responses of monocytes/macrophages. Because Leishmania is an intracellular infection of monocytes/macrophages, Leishmania-encoded MIF is hypothesized to sustain monocyte/macrophage survival and contribute to the persistence of the parasite for completion of its infectious life cycle. While these data are consistent with a role for Leishmania MIF in modulating host-immune responses, they do not exclude the possibility that Lm1740MIF may function in the growth and/or replication of the parasite.

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