Die Rolle der Janus-Kinasen-spezifischen Insertion (JSI) in JAK2

Schmidt, Daniela; Heinrich, Peter C.

doi:1608

Die Rolle der Janus-Kinasen-spezifischen Insertion (JSI) in JAK2

Schmidt, Daniela

2006

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Daniela Schmidt

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2006

Umfang79 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2006

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Heinrich, Peter C. (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2006-08-25

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-16088
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/61118/files/Schmidt_Daniela.pdf

Einrichtungen

Medizinische Fakultät (510000-1)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Medizin (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Interleukin-6 gehört zusammen mit IL-11, LIF, OSM, CNTF und CT-1 zur Familie der IL-6-Typ Zytokine. Es ist der Hauptmediator bei der Induktion der Akut-Phase-Proteinsynthese in Hepatozyten. Die Akut-Phase-Antwort ist Teil der systemischen Reaktion der Leber auf Infektionen, Entzündungen und Verletzungen. IL-6 löst diese systemische Reaktion als Hauptmediator aus. Die dabei gebildeten Akut-Phase-Proteine werden von den Hepatozyten freigesetzt und regulieren proteolytische Prozesse wie die Blutgerinnung und die Fibrinolyse bzw. aktivieren das Komplementsystem. IL-6 bindet zunächst an seinen IL-6-Rezeptor (gp80), wodurch es zur Induktion der Homodimerisierung von gp130 kommt. Gp130 ist die signalübertragende Komponente des Rezeptorkomplexes. Durch die Liganden-induzierte Rezeptordimerisierung werden die konstitutiv an gp130 assoziierten Protein-Tyrosinkinasen der Janus Familie (JAK1, JAK2, TYK2) aktiviert und phosphorylieren dann mehrere Tyrosinmotive im gp130. An diese können nun die Transkriptionsfaktoren STAT1 und STAT3 (signal transducers and activators of transcription) über ihre SH2-Domäne (src-Homologie-Domäne2) binden. Die Aktivierung der STAT-Proteine erfolgt wiederum durch die Janus Kinasen. Danach translozieren sie als aktive STAT1/1 bzw. STAT3/3 Homodimere oder als STAT1/3 Heterodimere in den Zellkern, wo sie an enhancer-Regionen von IL-6-Zielgenen wie zum Beispiel die der Akut-Phase-Proteine oder die der feedback Regulatoren der SOCS (suppressors of cytokine signaling) Familie binden. Die Janus Kinase JAK2 wird durch IL-6-Typ-Zytokine aktiviert. Weiterhin spielt sie eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion anderer Zytokine wie zum Beispiel Erythropoetin und Wachstumsfaktoren. Im Institut für Biochemie der RWTH Aachen wurde im rahmen von Untersuchungen zu SOCS-Proteinen ein Strukturmodell der Kinase-Domäne von JAK2 erstellt. Hierbei wurde ein Abschnitt von etwa 14 Aminosäuren identifiziert, die wir die JAK spezifische Insertion (JSI) nannten. Es zeigte sich, dass diese Insertion spezifisch für Janus Kinasen ist. Basierend auf diesen Resultaten und der Arbeit von Saharinen et al. (Regulation of the JAK2 Tyrosine Kinase by its kinase-like domain, Mol. Cell. Biol., 2000, 20, 3387) entstand die Idee zu dieser Arbeit. Saharinen et al. zeigten, dass die Pseudokinase-Domäne von JAK2 verantwortlich ist für die Negativregulation der Kinase-Domäne von JAK2. Wir postulierten, dass die JSI für die Interaktion mit der Pseudokinase-Domäne verantwortlich sein könnte. Zur Charakterisierung der JSI wurden ein Deletionskonstrukt (Delta JSI) sowie verschiedene Punktmutatanten von JAK2 (F1061A, M1062A, M1064A, I1065A) hergestellt. Im weiteren Verlauf zeigte sich, dass die Konstrukte F1061A, M1064A und I1065A ihre Kinaseaktivität durch die Mutation verloren hatten. Interessanterweise wurde die M1062A Mutante jedoch stärker phosphoryliert als Wildtyp JAK2. Zudem war sie in der Lage, den feedback Regulator SOCS3 (suppressor of cytokine signaling 3) stark zu phosphorylieren. Durch die Kombination von experimentellen molekularbiologischen Techniken mit theoretischen Ansätzen wie dem Molecular Modelling konnten wir somit eine Region innerhalb der JAK2 Kinase-Domäne identifizieren, der eine Rolle bei der Regulation der Kinase-Aktivität zugeschrieben werden kann. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die JSI jedoch nicht an der Interaktion zwischen der JH1 (Janus Kinase-Homologie-Domäne1) und JH2 (Janus Kinase-Homologie-Domäne2) beteiligt ist, sondern dass sie möglicherweise in die Substratbindung involviert ist. Im weiteren Verlauf soll geklärt werden, in welcher Weise die JSI die Kinase-Aktivität der JAKs beeinflusst. Derzeit werden JAK2 defiziente Zellen mit den verschiedenen Punktmutanten rekonstituiert, sodass sie stabil endogene Spiegel der Mutanten exprimieren, nicht jedoch die endogene Wildtyp JAK2.

The Janus Kinase JAK2 is activated by IL-6-type-cytokines. Furthermore it plays an important role within the signal transduction of other cytokines, as for example erythropoetin and growth factors. In the Institute for Biochemistry of the RWTH Aachen, a structured model of the Kinase domain of JAK 2 was provided. Here, a section of 14 amino acids was identified, which we called the JAK specific insertion (JSI). It was shown that this insertion is specific for Janus Kinases. Based on these results and the work of Saharinen et al. (“Regulation of the JAK2 Tyrosine Kinase by its Kinase like domain, Mol. of Cell. Biol., 2000, 20, 3387”), we proposed that the JAK specific insertion could be responsible for the negative regulation of the Kinase domain of JAK2 by its PseudoKinase domain. We cloned a deletion construct (delta JSI) as well as different point mutations of JAK2 (F1061A, M1062A, M1064A, I1065A). In the further process it showed up that the constructs F1061A, M1064A and I1065A had lost their Kinase activities by the mutations. Interestingly, the M1062A mutant was however more strongly phosphorylated than the wild type JAK2. Besides it was capable to phosphorylate the feedback modulator SOCS3 (suppressor of cytokine signaling 3). By the combination of experimental molecular-biological techniques with theoretical beginnings like the Molecular Modelling we could identify a region within the JAK2, which could be relevant for the regulation of the Kinase domain. Our data point on the fact that the JSI is not involved in the interaction between the JH1 (Janus Kinase-Homology-Domain 1) and the JH2 (Janus Kinase-Homology-Domain 2), but possibly in the substrate connection.

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