Confocal single molecule fluorescence detection - methodical developments and applications to biological specimens

Kempe, Daryan; Fitter, Jörg Ludwig; Wöll, Dominik

doi:10.18154/RWTH-2017-09658

Confocal single molecule fluorescence detection - methodical developments and applications to biological specimens

Kempe, Daryan

2017 & 2018

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Diplom-Physiker Daryan Kempe

ImpressumAachen 2017

Umfang1 Online-Ressource (xix, 130 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2017

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2018

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fitter, Jörg Ludwig (Thesis advisor)^RWTH* ; Wöll, Dominik (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2017-09-06

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2017-09658
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/708117/files/708117.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/708117/files/708117.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Förster resonance energy transfer (frei) ; confocal microscopy (frei) ; fluorescence correlation spectroscopy (frei) ; protein folding (frei) ; single molecule fluorescence spectroscopy (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 530

Kurzfassung
Immer wieder werden mit Hilfe von Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) Messungen auf Einzelmolekülniveau wertvolle Erkenntnisse in den Bereichen der molekularen Konformationsdynamik, der Faltung und der Strukturaufklärung von biologischen Makromolekülen erlangt. Quantitativeund präzise Aussagen können dabei nur mittels einer genauen Kalibrierung der erhobenen Daten gewonnen werden, welche unterem anderen die Eigenschaften der als FRET-Paar eingesetzten Farbstoffe berücksichtigen muss. In dieser Arbeit werden zwei Methoden entwickelt und etabliert, die es ermöglichen die benötigte Farbstoffcharakterisierung mit einem Konfokalmikroskop durchzuführen, folglich können die betrachteten FRET Proben unter anwendungsnahen Bedingungen, d.h. nahe dem Einzelmolekülniveau vermessen werden. Zuerst wird der für die Berechnung des Förster Radius benötigte Orientierungsfaktor mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzanisotropie Messungen abgeschätzt. Durch die in der Konfokalmikroskopie verwendeten Objektive mit hoher numerischer Apertur können dabei Depolarisationsartefakte auftreten, die durch zwei Korrekturfaktoren berücksichtigt werden müssen. Die präzise Bestimmung dieser Korrekturfaktoren wird in dieser Arbeit mit Hilfe der Kombination von theoretischen Vorhersagen mit einer erweiterten experimentellen, an das zeitliche Auflösungsvermögen des Systems angepassten Kalibrierungsprozedur erreicht. Um die Fluoreszenzquantenausbeuten von FRET Donor und Akzeptor zu bestimmen, die direkt in die Berechnung der FRET Effizienzen eingehen, wird die lineare Abhängigkeit der molekularen Helligkeit, zugänglich durch die Methode der Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie, von der Quantenausbeute im Grenzbereich kleiner Anregungsintensitäten ausgenutzt. Die darauf basierende Methode zur Quantenausbeutenbestimmung benötigt im Vergleich mit anderen häufig verwendeten optischen Verfahren nur einen Bruchteil (ca. drei Prozent) der Stoffmenge und ist dennoch mindestens genauso präzise. Durch ihre Sensibilität für dynamische und statische Fluoreszenzauslöschung ist die neu etablierte Methode zudem umfassender als andere Verfahren. Neben der Charakterisierung von Einzelmolekül FRET Proben ist sie generell zur Vermessung von (biologischen) Proben mit geringer Stoffmengenausbeute geeignet. Mit Hilfe der genannten methodischen Entwicklungen werden dann Einzelmolekül FRET Daten von strukturell rigiden, doppelsträngigen DNA Oligonukleotiden in reinem wässrigem Puffer und in Puffer mit bestimmten, hinzugegebenen Mengen von Glycerol, Guanidinhydrochlorid und Natriumchlorid analysiert. Es wird gezeigt, dass ohne die Korrektur von Solvens-induzierten photophysikalischen und spektralen Änderungen der fluoreszierenden Marker die berechneten Abstände zwischen Donor und Akzeptor-Farbstoff um bis zu 4 Å von den realen Abständen abweichen und zudem die zugrundeliegenden strukturellen Prozesse fehlinterpretiert werden. Zudem wird experimentell demonstriert und theoretisch untermauert, dass die elektrostatische Farbstoff-Farbstoff Repulsion für die betrachteten Abstände (> 50 Å) vernachlässigbar klein ist. Zuletzt werden alle methodischen Entwicklungen und experimentellen/theoretischen Resultate kombiniert um Erkenntnise über den schon entfalteten Zustand des Proteins Phosphoglyceratkinase in Abhängigkeit von der Denaturierungsmittelkonzentration zu gewinnen.

Over the last few decades, single-molecule FRET has become a valuable tool enlightening the fields of molecular conformational dynamics, folding and structure determination of biological macro-molecules. However, quantitative statements about any parameter obtained using FRET are based on aprecise calibration of the acquired data, among others taking into account the properties of the FRET-pair used. In this work, two methods are developed and established that facilitate this calibration by means of confocal microscopy, automatically allowing a sample characterization under application relevant conditions, i.e. close to the single-molecule level. To assess the orientation factor entering the Förster radius calculation, time-resolved anisotropy measurements are performed. In this regard, the depolarization effects induced by the use of a high numerical aperture objective have to be taken into account by two correction factors. These are precisely determined by combining an extended experimental calibration procedure adjusted to the temporal resolution of the setup at hand with theoretical predictions considering the exact measurement conditions. To determine the fluorescence quantum yields of donor and acceptor used in the FRET efficiency calculation, the linear relation between the molecular brightness, made accessible by Fluorescence Correlation Spectroscopy, and the fluorescence quantum yield in the limit of low excitation intensities is exploited. Based on this, the presented quantum yield determination method lowers the needed amount of sample by a factor of around thirty as compared to a commonly applied optical method, but still provides at least the same precision. As compared to fluorescence lifetime based quantum yield determination methods, the novel approach is more comprehensive as it is sensitive not only to dynamic, but also to static fluorescence quenching. Hence, apart from its relevance for smFRET, a reliable characterization of biological samples with limited expression yields is made possible. With these two methodical developments available, smFRET data of structurally rigid, double-stranded DNA oligonucleotides in aqueous buffer and in buffers with specific amounts of glycerol, guanidine hydrochloride and sodium chloride added are analyzed. It is demonstrated that the calculation of inter-dye distances, without taking into account solvent-induced spectral and photo-physical changes of the labels, leads to deviations of up to 4 Å from the real inter-dye distances and furthermore to a misinterpretation of the underlying structural changes. Additionally, it is experimentally shown that electrostatic dye dye repulsions are negligible for the inter-dye distance regime considered here (> 50 Å ). Expanding the given framework of accessible volume calculations by taking into account the electrostatic interaction potential of donor and acceptor in the respective solvent environment, these findings are supported by theoretical predictions. Finally, all methodical approaches and experimental/theoretical findings are combined to validate the further compaction of the already unfolded state of the protein Phosphoglycerate Kinase (PGK) with decreasing concentrations of denaturant, a mechanism known as coil-globule transition.

OpenAccess:
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