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Optimization of itaconic acid production by U. maydis through metabolic engineering & adaptive laboratory evolution
2019 & 2020
Dissertation, RWTH Aachen University, 2019
Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2020
Genehmigende Fakultät
Fak01
Hauptberichter/Gutachter
;
Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2019-07-17
Online
DOI: 10.18154/RWTH-2020-01372
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/781564/files/781564.pdf
Einrichtungen
Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
itaconic acid (frei) ; ustilago maydis (frei)
Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570
Kurzfassung
Das stetige Wachstum der Weltbevölkerung führt zu einem bereits jetzt schon gigantischen und immer noch weiter wachsenden Bedarf an Nahrung, Energie, Brennstoffen und Chemikalien. Aufgrund der Endlichkeit fossiler Ressourcen, die überwiegend als Ausgangstoffe verwendet werden, ist ein Wechsel von Erdöl-basierten hin zu nachhaltigen, wirtschaftlich bio-basierten Produktprozessen unabdingbar, um auch in Zukunft die globalen Bedürfnisse decken zu können. Einen dieser Prozesse stellt die Produktion von Itaconsäure dar, welche als eine der Top 12 aus Biomasse hergestellten Mehrwert-Chemikalien vom DoE eingestuft wurde. Heutzutage erfolgt die biotechnologische Itaconsäure-Produktion im industriellen Maßstab mithilfe des filamentösen Pilzes Aspergillus terreus. Um die Probleme zu umgehen, die ein derartig wachsender Produktionswirt mit sich bringt, wird nach Alternativen gesucht. In diesem Zusammenhang gewann die Ustilaginaceae-Familie, einschließlich U. maydis, besondere Aufmerksamkeit.Zwei Strategien wurden nun im Laufe dieser Arbeit mit dem Ziel verfolgt, einen industriell einsetzbaren, gegenüber A. terreus konkurrenzfähigen Itaconsäure-Produktionswirt zu etablieren und die Itaconsäure-Produktionsleistung von U. maydis wesentlich zu verbessern: Metabolic Engineering und adaptive Laborentwicklung. Die Verkleinerung des vielfältigen Produktionsspektrums von U. maydis MB215 durch die Deletion der 2- Hydroxyparaconat-, Mannosylerythritollipid-, Ustilaginsäure- und Triacylglycerol-Biosynthese in Kombination mit der Hochregulierung von ria1, dem Regulator des für die Itaconsäure zuständigen Genclusters, führte zu einem erheblich gesteigerten Substratfluss in Richtung Itaconsäure-Biosynthese. Der Itaconsäure-Titer konnte so gegenüber des Wildtyps um das 10,2-fache gesteigert werden. Aufgrund der Hochregulierung des Cis-Aconitat/Malat-Antiporters mtt1 als Folge der ria1-Überexpression konnte gleichzeitig die Produktion von Malat, eines weiteren Nebenproduktes, um 84 % reduziert werden. Weitere Metabolic-Engineering-Strategien wurden in diesem Nebenprodukt-reduzierten U. maydis Stamm verfolgt: die Vermeidung filamentösen Wachstums durch die Deletion von fuz7 und die Überexpression des Gens mttA, welches für den mitochondrialen Tricarboxylat-Transporter in A. terreus codiert. Der designte ∆fuz7-Stamm wies deutlich verbesserte Produktionsparameter auf. Dies zeigte sich vor allem in einer um 25 % erhöhten Ausbeute aus Glucose. Mit der zusätzlichen Insertion von PetefmttA konnte dies noch gesteigert werden. Ein Klon mit dreifacher PetefmttA-Kopie erreichte einen Itaconsäure-Titer von 54 g L-1 und eine maximale Ausbeute von 0.64 gITA gglu-1, welche 89 % des theoretisch möglichen Wertes entspricht. Diese großartigen Verbesserungen hinsichtlich der Itaconsäure-Produktion bedeuten aber gleichzeitig ein erhöhtes metabolisches und osmotisches Stresslevel für die Zellen. Um diesem entgegenzuwirken sollte mithilfe von adaptiver Laborentwicklung ein Stamm generiert werden, welcher über eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen pH-Werten und eine erhöhte Produktresistenz gegenüber Itaconsäure verfügt. Die Fitness von U. maydis konnte erheblich verbessert werden, was sich in Stämmen widerspiegelte, die in der Lage waren, auf pH 4 und in der Anwesenheit von 40 g L-1 Itaconsäure zu wachsen. Jedoch führte die Zusammenführung aller wichtigen, in dieser Arbeit identifizierten Modifikationen in einem Stamm zu einem Verlust dieser Toleranz. Vor allem die Deletion der Triacylglycerol-Produktion scheint die Zellen auf lange Sicht erheblich zu destabilisieren - machen diese Lipide doch den Hauptanteil an Energiereserven für die Zellen aus. Jedoch zeigen die Ergebnisse im Gesamten deutlich, dass die finalen Stämme großartige, weitreichend optimierte Produktionsparameter besitzen, die nah an das theoretische Maximum heranreichen. Diese Entwicklung macht U. maydis - neben A. terreus - zu einem industriell relevanten Produktionswirt für Itaconsäure.The incessant growth of the world population leads to an already gigantic and still increasing demand for food, energy, fuels, and chemicals. With the finiteness of fossil resources as main feedstocks, a change from petroleum-derived to sustainable, economically bio-based production processes is indispensable to accomplish the global needs. One of these processes is the production of itaconic acid ranked as one of the top 12 value added chemicals from biomass by the DoE. Nowadays, industrial biotechnological production is performed by using the filamentous fungus Aspergillus terreus. To circumvent the challenges going along with such a filamentous production host, alternatives are searched. In this context, the Ustilaginaceae family including Ustilago maydis attracted special attention. To establish an industrial itaconate production host competitive to A. terreus and to significantly improve the itaconate production performance of U. maydis, two strategies were chased in this thesis: metabolic engineering and adaptive laboratory evolution. By the reduction of the diverse by-product spectrum of U. maydis MB215 by the deletion of 2-hydroxy paraconate, mannosyl-erythritol lipid, ustilagic acid and triacylglycerol biosynthesis in combination with the upregulation of ria1, the itaconate biosynthesis gene cluster regulator, the flow of substrate could be extensively pushed towards itaconate biosynthesis. This lead to an itaconate titer increased by 10.2-fold compared to the wildtype. Due to the upregulation of the cis-aconitate/malate antiporter mtt1 as consequence of ria1↑, the production of malate, another by-product, could simultaneously be decreased by 84 %.In this by-product reduced U. maydis strain, further metabolic engineering steps were performed: filamentous growth prevention by fuz7 deletion and overexpression of mttA encoding for the A. terreus mitochondrial tricarboxylate transporter. By ∆fuz7, the designed strain was able to produce itaconate with improved production parameters, especially with an 25% increased yield from glucose. This could even be outplayed by additional PetefmttA insertion. A clone with three PetefmttA copies reached an itaconate titer of 54 g L-1 and a maximal yield of 0.64 gITA gglu-1, which corresponds to 89 % of the theoretical value. The great itaconate production improvements imply a higher metabolic and osmotic stress level for the cells. Adaptive laboratory evolution was therefore used to generate a strain with increased low pH and product resistance to itaconate. The fitness of U. maydis could be significantly improved represented by strains able to grow at pH 4 and in the presents of 40 g L-1 itaconate. The consolidation of all major modifications identified in this thesis in one strain, though, resulted in a loss of this tolerance. Especially the deletion of triacylglycerol production, the cells rely on as main energy reserves, seems to destabilize the cells in the long term. However, the results clearly illustrate that the final engineered strains feature great, far optimized itaconate production parameters close to the theoretical maximum making U. maydis - besides A. terreus - an industrial relevant production host for itaconic acid.
OpenAccess: 
PDF
(additional files)
Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis/Book
Format
online, print
Sprache
English
Externe Identnummern
HBZ: HT020358677
Interne Identnummern
RWTH-2020-01372
Datensatz-ID: 781564
Beteiligte Länder
Germany
