Mast cell activation by supra-optimal antigen concentrations - a promising condition to identify novel regulators of FcεRI signaling

Gast, Mathias; Lüscher, Bernhard; Huber, Michael

doi:HT020400087

Mast cell activation by supra-optimal antigen concentrations - a promising condition to identify novel regulators of FcεRI signaling = Mastzellaktivierung mit supraoptimalen Antigenkonzentrationen - eine vielversprechende Bedingung zur Identifikation neuer Regulatoren der FcεRI-Signaltransduktion

Gast, Mathias^RWTH*

2019 & 2020

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Mathias Gast, Diplom Biologe

ImpressumAachen 2019

Umfang1 Online-Ressource (108 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2020

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Huber, Michael (Thesis advisor)^RWTH* ; Lüscher, Bernhard (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2019-10-08

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2020-03271
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/785519/files/785519.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
FcγRIIB (frei) ; FcεRI (frei) ; SHIP1 (frei) ; mast cells (frei) ; negative regulation (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Aktivierung des hochaffinen Rezeptors für IgE (FcεRI) folgt einer glockenförmigen Dosis-Wirkungs-Kurve. Nach Stimulation mit einer supra-optimalen Antigenkonzentration, werden die Effektorantworten der Mastzelle durch inhibitorische Moleküle herunterreguliert. Bei diesem Prozess sind unter anderem die SH2-enthaltende Inositol-5’-Phosphatase SHIP1 und die SRC-Kinase LYN von zentraler Bedeutung. Um weitere Proteine zu identifizieren, die an einem negativregulatorischen Signalosom beteiligt sind, haben wir ein Screening durchgeführt, in dem wir nach Proteinen suchten, deren Tyrosinphosphorylierungsmuster dem von SHIP1 entspricht. Die Phosphorylierung der Tyrosinreste dieser, für die Negativregulation entscheidenden, Lipidphosphatase steigt analog zur Antigenkonzentration an und ist am stärksten ausgeprägt bei supra-optimalen Konzentrationen. Wir fanden heraus, dass der niedrigaffine IgG-Rezeptor FcγRIIB nach Antigenstimulation ebenfalls phosphoryliert wird. Diese Phosphorylierung ist wie bei SHIP1 unter supra-optimalen Bedingungen am stärksten ausgeprägt und die Konsequenz einer passiven, antigen- bzw. IgE-abhängigen sowie progressiven Kolokalisation von FcεRI und FcγRIIB. Sie ist unabhängig von IgG und erfolgt nach der supra-optimalen Quervernetzung von FcεRI durch die Tyrosinkinase LYN. Dies hat die Rekrutierung von SHIP1 mittels des FcγRIIB ITIM zur Folge, was den beteiligten Tyrosinrest (Y309) im ITIM vor unmittelbarer Dephosphorylierung bewahrt. Die Analyse FcγRIIB-defizienter BMMCs ergab keine eindeutige Veränderung im Phänotyp nach Antigenstimulation. In Abwesenheit von FcγRIIB waren einerseits sowohl die SHIP1-Phosphorylierung signifikant verringert als auch die Kalziummobilisierung verstärkt, was für eine Beteiligung des Rezeptors an der SHIP1-abhängigen supra-optimalen Negativregulation der Mastzellaktivierung spricht. Andererseits war in diesen Zellen die Degranulierung nicht und die IL-6 Produktion nur geringfügig erhöht. Insgesamt zeigen unsere Daten das LYN/FcγRIIB/SHIP1 Signalosom im Kontext der FcεRI Aktivierung, insbesondere bei supra-optimalen Antigenkonzentrationen. Die Tatsache, dass nicht allein der FcγRIIB die Aktivierung bzw. Tyrosinphosphorylierung von SHIP1 gewährleistet, unterstreicht die besondere Bedeutung dieses Proteins für die Regulation der FcεRI-abhängigen Mastzellaktivierung. Weiterhin zeigt dies die Notwendigkeit, die Rekrutierung von SHIP1 engmaschig durch andere Moleküle abzusichern, um die Funktion der Phosphatase zu gewährleisten. In die Einleitung von Mastzellantworten durch FcεRI und KIT sind ähnliche Signalwege und Mechanismen, wie etwa der PI3K-Signalweg, der MAPK-Signalweg und auch die Mobilisierung von zellulärem Kalzium einbezogen. Während die separate Stimulation der beiden Rezeptoren zu unterschiedlichen Zellantworten führt, bewirkt eine Kostimulation beider Rezeptoren mit SF und Ag eine KIT-abhängige Verstärkung der durch FcεRI ausgelösten Degranulierung und Zytokinproduktion. Um diesen synergistischen Effekt auslösen zu können, müssen die Signalprozesse beider Rezeptoren integriert werden. Vor dem Hintergrund des stark ausgeprägten strukturellen Synergismusses zwischen der Signaltransduktion von FcεRI und KIT, beschreiben wir die antigenabhängige Tyrosinphosphorylierung und Internalisierung von KIT in Abwesenheit von SF. Wir beobachteten, dass die Stimulation von Mastzellen mit Antigen die Phosphorylierung von KIT an Y719 zur Folge hat. Die Phosphorylierung wird durch LYN katalysiert und ihre Ausprägung ist abhängig von der Antigenkonzentration. Da die intrinsische Tyrosinkinaseaktivität für die Entstehung der Phosphorylierung nicht benötigt wird, kann man vermuten, dass die antigenabhängige Phosphorylierung von Y719 höchst wahrscheinlich auch unabhängig von einer KIT-Dimerisierung ist. Diese wird klassischerweise durch die Stimulation mit SF hervorgerufen und von einer Autophosphorylierung an Y719 begleitet. Weiterhin deuten unsere Daten darauf hin, dass die SF-unabhängige Rekrutierung von KIT möglicherweise einen negativen regulatorischen Einfluss auf frühe Effektormechanismen der antigengesteuerten Mastzellantwort ausübt. Der Vergleich von KIT-defizienten und WT BMMCs zeigte, dass die Freisetzung von β-Hexosaminidase nach Antigenstimulation in Abwesenheit von KIT signifikant erhöht ist, insbesondere bei supra-optimalen Antigenkonzentrationen. Im Gegensatz dazu erscheint die antigenabhängige Produktion von Zytokinen unbeeinträchtigt.

Activation of the high-affinity receptor for IgE (FcεRI) follows a bell-shaped dose-response curve. Upon supra-optimal stimulation, mast cell effector responses are down-regulated by inhibitory molecules like the SH2-containing inositol-5’-phosphatase SHIP1 and the SRC-family-kinase LYN. To identify further molecules involved in a negative regulatory signalosome, we screened for proteins showing the same pattern of tyrosine phosphorylation as SHIP1, which is tyrosine-phosphorylated strongest upon supra-optimal antigen stimulation. The low-affinity IgG receptor, FcγRIIB, was found to be most strongly phosphorylated under supra-optimal conditions. This phosphorylation is the consequence of passive, antigen/IgE-dependent and progressive co-localization of FcεRI and FcγRIIB, which is not dependent on IgG. Upon supra-optimal FcεRI cross-linking, FcγRIIB phosphorylation is executed by LYN and protected from dephosphorylation by SHIP1. Analysis of FcγRIIB-deficient bone marrow-derived mast cells revealed an ambiguous phenotype upon Ag stimulation. Absence of FcγRIIB significantly diminished the level of SHIP1 phosphorylation and resulted in augmented Ca2+ mobilization, which indicates a contribution of this receptor to SHIP1-dependent negative regulation of mast cell activation. Though, degranulation and IL-6 production were not or only weakly enhanced, respectively. Altogether our data establish the LYN/FcγRIIB/SHIP1 signalosome in the context of FcεRI activation, particularly at supra-optimal antigen concentrations. The fact that SHIP1 tyrosine phosphorylation/activation not only depends on FcγRIIB, highlights the necessity for its tight backup control. Initiation of mast cell responses through FcεRI and the receptor tyrosine kinase KIT involves similar signaling pathways and mechanisms such as the PI3K pathway, the MAPK pathway, as well as Ca2+ mobilization. While separate stimulation of both receptors results in distinct cellular responses, co-stimulation with SF and Ag causes KIT-dependent enhancement of FcεRI-driven degranulation and cytokine production. To initiate this synergistic effect, signaling processes that are induced by both receptors must be integrated. Considering the high level of structural synergism between FcεRI and KIT signaling, we describe Ag-driven tyrosine phosphorylation and internalization of KIT in the absence of SF. We observed that KIT was phosphorylated at Y719 by LYN upon Ag stimulation in a concentration-dependent manner. As this process did not require the intrinsic tyrosine-protein kinase activity of the receptor it must be assumed that Ag-driven Y719 phosphorylation is most likely independent of KIT dimerization. This is triggered by SF-based KIT activation and accompanied by its autophosphorylation at Y719. Our data further indicate that Ag-based KIT recruitment could possibly exert a negative regulatory influence on early Ag-driven MC-responses. Comparison of KIT-deficient and WT BMMCs revealed that in the absence of KIT β-hexosaminidase release in response to Ag stimulation was significantly enhanced. In contrast, Ag-triggered cytokine production remained unaffected in KIT-deficient BMMCs.

OpenAccess:
PDF
(zusätzliche Dateien)