Duality of the lytic phages Sb-1 and NP-3 : How well does co-predation work against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa under varying environmental conditions?

Simon, Kevin; Panstruga, Ralph; Horz, Hans-Peter

doi:HT021627427

Duality of the lytic phages Sb-1 and NP-3 : How well does co-predation work against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa under varying environmental conditions?

Simon, Kevin^RWTH*

2022 & 2023

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Kevin Simon, Master of Science

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2022

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2023

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Horz, Hans-Peter (Thesis advisor)^RWTH* ; Panstruga, Ralph (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2022-11-03

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2022-10728
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/856231/files/856231.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Pseudomonas aeruginosa (frei) ; RNA-Seq (frei) ; Staphylococcus aureus (frei) ; bacteriophage (frei) ; coinfection (frei) ; phage-antibiotic synergy (frei) ; transcriptomics (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
In der Ära der Antibiotikakrise fischen wir in trüben Gewässern, wie der steigenden Zahl an multi-resistenten Bakterien (MRB) mit geeigneten Maßnahmen zu begegnen ist. Phagentherapie könnte eine Alternative für die topische Behandlung von chronischen Wundinfektionen sein, wo typischerweise Staphylococcus aureus (SA) und Pseudomonas aeruginosa (PA) zusammen die Infektion vorantreiben. Im Gegensatz zu vielen Monokultur-Studien war es Ziel dieser Studie den simultanen Einsatz des SA-Phagen Sb-1 und des PA-Phagen NP-3 mit oder ohne dem Antibiotika Meropenem (MP) bei einer bakteriellen Ko-Kultur von SA und PA zu untersuchen. Akkurate Spezies-spezifische Zählung beider Bakterien und Phagen gelang weder mit Plasmiden, die für Fluoreszenzproteine kodieren, noch dem fluoreszierenden Pyoverdine, das von PA auf natürlicher Weise produziert wird, noch dem „Fluorescence activated cell sorting“ (FACS). Stattdessen war die quantitative PCR (qPCR) mit gleichzeitigem Ausplattieren der Bakterien und dem Spotten von Phagen hinreichend präzise ohne Interferenz zwischen beiden Bakterienspezies, den beiden Phagen und MP. Flüssigkultur-Assays mit Sb-1 und NP-3 in Kombination mit MP zeigten, dass Phagen und β-Lactam-Antibiotika meistens förderlich in der Eliminierung bakterieller Monokulturen zusammenarbeiten. Im Gegensatz dazu behinderten sich beide Phagen gegenseitig, wenn sie zu einer Ko-Kultur ihrer unterschiedlichen Wirte gegeben wurden. Die Runterregulierung der Bakterien- und Phagen-Genexpression bewirkte eine langsamere Vermehrung der Phagen und ein verzögertes Töten der Bakterien. Demgegenüber stellte die Zugabe von MP die antibakterielle Aktivität beider Phagen nicht nur wieder her, sondern verstärkte diese sogar mittels drastischer Hochregulierung ihrer Genexpression. Diese Phagen-Wirt-Antibiotikum Interaktionen waren weitgehend zwischen Kulturmedium, equinem Serum und einem Schweinehautmodell vergleichbar, erstreckten sich jedoch über unterschiedliche Zeiträume. Zusätzlich wurde herausgefunden, dass die Phagen in metabolisch inaktiven Bakterien „überwintern“ können. Sie replizieren dabei latent in ihrem Wirt, produzieren aber erst neue Phagen-Nachkommen, wenn der infizierte Wirt zu einem aktiven Metabolismus zurückkehrt. Zusammenfassend betrachtet ist die Verifizierung der Kompatibilität von Phagen in Cocktails essenziell für die Generierung synthetischer Phagengemeinschaften mit einem bedeutsamen Effekt gegen bakterielle Pathogene in gemischten Infektionen. Bemerkenswert ist, dass Antibiotika, die nutzlos gegen MRB geworden sind, immer noch von therapeutischem Wert sind, da sie nicht nur negative Interaktionen zwischen Phagen zu überwinden helfen, sondern die bakterielle Eliminierung durch Phagen verstärken. Das Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen der Räuber-Beute- Beziehungen über bakterielle Monokulturen hinaus bringt uns der Realisierung eines Phagen-basierten Konzepts gegen MRB einen wichtigen Schritt weiter.

In the area of the antibiotic-crisis we fish in troubled water how to counter the uprising number of multi-drug resistant bacteria (MDR). Phage therapy could be an alternative for topical treatment of chronic wound infections where typically Staphylococcus aureus (SA) and Pseudomonas aeruginosa (PA) together drive the infection. In contrast to the high number of mono-culture studies, this study investigated the simultaneous challenge of a bacterial co-culture of SA and PA with the SA-phage Sb-1, the PA-phage NP-3 and the antibiotic meropenem (MP). Accurate species-specific enumeration of both bacteria and phages was neither achieved with fluorescence proteins encoding plasmids, nor the fluorescence compound pyoverdine naturally produced by PA, nor fluorescence activated cell sorting (FACS). Instead, quantitative PCR (qPCR) along with bacterial plating and phage spotting was highly precise with no interferences between the bacterial species, the two phages and MP. Liquid culture assays with Sb-1 or NP 3 in combination with MP showed that phages and β-lactam antibiotics work mostly beneficial in clearing bacterial monocultures. In contrast, in co-cultures, both phages interfered with each other while preying on their different hosts. The downregulation of bacterial and phage gene expression caused a prolonged phage propagation and a delayed antibacterial killing. Conversely, the addition of MP not only restored, but also enhanced phage based bacterial clearance by the strong upregulation of phage gene expression. All these phage-host antibiotic interactions were largely comparable between culture medium, equine serum and in a pig skin model, but occurred over different time scales. In addition, it was found, that the phages “hibernated” in metabolic inactive bacterial cells. They latently replicated in their host but started to produce new phage progenies only when the infected hosts switched back to active metabolism. As a conclusion, the assessments of phage compatibilities in cocktails are vital for generating synthetic phage communities with meaningful effects against bacterial pathogens in mixed infections. Notably, antibiotics which have become useless against MDR, are still of therapeutic value, as they not only assist in overcoming negative phage interactions, but boost phage based bacterial killing. Understanding the underlying molecular mechanisms of predator-prey relationships beyond bacterial monocultures takes us one important step further towards phage-based therapeutic concepts against MDR.

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