Development of a 3D innervated skin model integrating anisotrophic guidance elements

Nag Biswas, Srijeeta; Lampert, Angelika; De Laporte, Laura

doi:10.18154/RWTH-2024-03616

Development of a 3D innervated skin model integrating anisotrophic guidance elements

Nag Biswas, Srijeeta^RWTH*

2023 & 2024

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Srijeeta Nag Biswas, M.Sc.

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2023

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2023

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2024

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Lampert, Angelika (Thesis advisor)^RWTH* ; De Laporte, Laura (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2023-12-11

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2024-03616
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/983672/files/983672.pdf

Einrichtungen

Projekte

GRK 2415 - GRK 2415: Mechanobiology in Epithelial 3D Tissue Constructs (363055819) (363055819)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
3D hydrogel (frei) ; anisogel (frei) ; dorsal root ganglia (frei) ; innervated skin model (frei) ; keratinocyte (frei) ; neurite guidance (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Die Haut ist ein hochspezialisiertes Organ, das somatosensorische Neuronen enthält, die Signale aus der Umgebung und dem Inneren des Körpers an das Rückenmark projizieren. Die unmittelbare Nähe der primären afferenten freien Nervenendigungen und der Keratinozyten in der Epidermis ermöglicht eine parakrine Kommunikation, die räumlich differenziert ist und Entzündungen, Immunaktivierung, Wärmeregulierung, Juckreiz und Schmerzen vermittelt. Zusätzlich zur sensorischen Transduktion bildet die Sekretion löslicher Faktoren durch freie Nervenendigungen und Keratinozyten eine sensorische Rückkopplungsschleife in der Haut, die die Gewebehomöostase aufrechterhält, indem sie eine optimale epidermale Trophizität ermöglicht und die epidermale Innervation erhält. Das chronische Schmerzsyndrom Small-Fiber-Neuropathie geht z. B. häufig mit einer reduzierten intraepidermalen Kleinfaser-Dichte einher. Der komplexe Cross-Talk zwischen Keratinozyten und sensorischen Neuronen erfordert eine umfassende Untersuchung beider Zelltypen. Hautmodelle aus dem Bereich des Tissue-engineerings sind eine praktikable Methode, um neurokutane Interaktionen mit einer geschichteten Epidermis in einer kontrollierten Umgebung zu simulieren. Die Integration von Patienten-abgeleiteten Zellen hilft bei der Modellierung spezifischer Krankheitszustände. Die Wahl der Materialien für die Konstruktion dieser Modelle erlaubt es, auf die mechanistischen Merkmale Einfluss zu nehmen, und ermöglicht die Modulation der Zellentwicklung und der zellulären Interaktionen mit dem umgebenden Substrat. Die bisher bekannten gewebetechnisch erstellten innervierten Hautmodelle erleichtern das Neuritenwachstum durch chemotrophe Steuerung, indem sie Begleitzellen wie Keratinozyten, Immunzellen und Schwann-Zellen einbeziehen. Die meisten dieser Modelle weisen trotz ihrer langen Entwicklungszeit nur geringe Neuriteninteraktionen mit Keratinozyten auf. Umgekehrt haben Studien zur Nervenregeneration zur Steuerung des Neuritenwachstums eine topografiebasierte Steuerung verwendet, z. B. Nanofaserschläuche oder Gerüste. Die Kombination beider Ansätze könnte die Wirksamkeit der Lenkung von Neuriten in die Keratinozytenschicht erhöhen. Natürliche Hydrogelgerüste wie Kollagen und Gelatine sind aufgrund ihrer inhärenten Biokompatibilität eine beliebte Wahl, weisen jedoch unzureichende mechanische Eigenschaften und Schwankungen von Charge zu Charge auf. Synthetischen Polymer-Hydrogelen mangelt es zwar an Bioaktivität, sie können jedoch so angepasst werden, dass sie konstante mechanische Eigenschaften, biologische Abbaubarkeit und nützliche Funktionen aufweisen. Mit dieser Arbeit entwickle ich die Grundlagen eines 3D-Modells der innervierten Haut, das Neuriten zum einen chemotrop, zum anderen durch topografische Leitstrukturen durch magnetoresponsive Mikrogele gerichtet wachsen lässt. In Zusammenarbeit mit dem Labor von Prof. De Laporte (DWI-Leibniz-Institut für Interaktive Materialien, Aachen) wurde Anisogel, ein Fibrin-mimetisches Hydrogel auf Poly(ethylenglykol)-Basis, als Gerüst verwendet. Explantate des sensorischen Spinalganglions (DRG) der Maus wurden in weiches Anisogel eingekapselt. Matrixmetalloproteinase-empfindliche Domänen im Gerüst ermöglichen den zellinduzierten Abbau. Dies ermöglicht ein ungehindertes Wachstum der DRG-Neuriten. Bevor das Gerüst geliert wurde, wurden die magnetoresponsiven Mikrogele in der gewünschten Konfiguration ausgerichtet. Der Unterschied in der Substratsteifigkeit zwischen dem weichen Gerüst und den deutlich steiferen Mikrogelen führte dazu, dass die Neuriten entlang der Mikrogele wuchsen. Um die vertikale Entwicklung primärer afferenter Nervenendigungen in der geschichteten Epidermis der natürlichen Haut nachzuahmen, wurde das vertikale Wachstum von DRG-Neuriten der Maus mit einem Anisogel erreicht. Außerdem konnte ich zeigen, dass Keratinozyten in Co-Kultur mit Maus-DRG-Explantaten das gerichtete Wachstum der Neuriten hin zur Keratinozytenschicht auf der Oberfläche des Konstrukts verstärkten. Die Oberfläche des Gerüsts wurde mit Kollagen modifiziert, um das gleichmäßige Wachstum der hochproliferativen Keratinozyten zu unterstützen und gleichzeitig die Struktur des Gerüsts zu erhalten. Mit dem in dieser Studie vorgestellten 3D-Hautmodell auf Anisogel-Basis wurde also erfolgreich ein gerichtetes Neuritenwachstum durch topografische Führung zusammen mit trophischen Hinweisen durch Keratinozyten erreicht.

The skin is a highly specialized organ, which contains somatosensory neurons that project signals from the surrounding and the inside of the body to the spinal cord. The close proximity of the primary afferent free nerve endings of the free nerve endings and keratinocytes in the epidermis allows paracrine communication which is spatially differentiated and mediates inflammation, immune activation, thermal regulation, itching, and pain. In addition to sensory transduction, the secretion of soluble factors by free nerve endings and keratinocytes forms a sensory feedback loop in the skin, maintaining tissue homeostasis by facilitating optimal epidermal trophicity and preserving epidermal innervation. The chronic pain syndrome small fiber neuropathy, e.g. often goes along with reduced interepidermal small fiber density. The complex cross-talk between keratinocytes and sensory neurons requires comprehensive investigation of both cell types. Tissue-engineered skin models have the potential to be a feasible method for simulating neurocutaneous interactions with a stratified epidermis in a controlled setting. Integration of disease-specific cells helps modelling specific disease conditions. The choice of materials to construct these models provide a significant degree of control over the mechanistic features, allowing the modulation of cell development and cellular interactions with the surrounding substrate. Tissue-engineered innervated skin models reported so far facilitate neurite growth via chemotrophic guidance by incorporating companion cells, such as keratinocytes, immune cells, and Schwann cells. Most of these models exhibit modest neurite interactions with keratinocytes, despite their lengthy development times. Conversely, to guide neurite growth, nerve regeneration studies have used topography-based guidance, such as nanofibre tubes or scaffolds. The combination of both approaches may enhance the efficacy of directing neurites to the keratinocyte layer. Natural hydrogel scaffolds such as collagen and gelatin are popular choices owing to their inherent biocompatibility but exhibit inadequate mechanistic properties and batch-to-batch variations. Although synthetic polymer hydrogels lack bioactivity, they can be tailored to achieve constant mechanical properties, biodegradability, and beneficial functions. In this thesis, I aimed to develop a 3D model of innervated skin using chemotropic guidance and topographic cues introduced by magnetoresponsive microgels. In collaboration with the De Laporte group (DWI-Leibniz-Institut für Interaktive Materialien, Aachen), Anisogel, a fibrin-mimetic poly(ethylene glycol) based hydrogel, was used as a scaffold. Mouse sensory dorsal root ganglion (DRG) explants were encapsulated in soft Anisogel. Matrix metalloproteinase-sensitive domains in the scaffold enable cell-induced degradation. This permits unrestricted growth of DRG neurites. Before the scaffold was gelated, the magnetoresponsive microgels were oriented to the desired configuration. The difference in substrate stiffness between the soft scaffold and the significantly stiffer microgels guided neurite outgrowth along the microgels. To mimic the vertical development of primary afferent nerve endings into the stratified epidermis in native skin, the vertical growth of mouse DRG neurites was achieved using an Anisogel. I showed that keratinocytes, in co-cultured with mouse DRG explants, enhanced the directional growth of neurites towards the keratinocyte layer on the surface of the construct. The scaffold surface was modified with collagen to support the uniform growth of highly proliferative keratinocytes, while preserving the structure of the scaffold. Thus, the 3D Anisogel-based skin model reported in this study successfully achieved directional neurite growth using topographical guidance along with trophic cues provided by keratinocytes.

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