Scaffold-free models for tissue engineering

Rimal, Rahul; Möller, Martin; Ludwig, Andreas

doi:10.18154/RWTH-2024-03644

Scaffold-free models for tissue engineering = Scaffold-freie Modelle für das Tissue Engineering

Rimal, Rahul^RWTH*

2024

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Rahul Rimal, M.Sc.

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2024

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2024

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Möller, Martin (Thesis advisor)^RWTH* ; Ludwig, Andreas (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2024-03-20

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2024-03644
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/983712/files/983712.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
scaffold-free (frei) ; skin models (frei) ; tissue engineering (frei) ; vascularization (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Das Voranschreiten von Tissue-Engineering Verfahren hat eine alternative Strategie zur Prüfung und Vorhersage der Wirksamkeit und Sicherheit neuer Arzneimittel und Kosmetika ermöglicht. Der Bedarf an dreidimensionalen (3D) organotypischen Modellen ist auf die Limitierungen der herkömmlichen Testplattformen zurückzuführen. Zu diesen Plattformen gehören 2D-Modelle, die die komplexe Architektur des menschlichen Gewebes nicht nachbilden können, und Tiermodelle, die mit ethischen Problemen behaftet sind. Um mit diesen bestehenden Plattformen konkurrieren zu können, sollten organotypische 3D-Modelle die langlebig und stabil sein. Die meisten In-vitro-Studien werden jedoch nur über einen kurzen Zeitraum durchgeführt, dies verhindert ein genaueres Verständnis des fortwährenden Krankheitsverlaufs, des Langzeiteffekts angewandter Medikamente und der Folgen eines Absetzens der Behandlung. In dieser Arbeit wurde zur Herstellung von 3D-Hautgewebemodellen die ECM-Zellbeschichtung und -Akkumulationstechnik verwendet, bei der einzelne dermale Fibroblasten schichtweise mit Fibronectin (FN) und Gelatine (G) beschichtet wurden. Nachdem sich die beschichteten Zellen in einem begrenzten Raum angesammelt haben, interagieren sie miteinander und bilden ein Scaffold freies 3D-Gewebe. Auf die gebildete dermis wurden menschliche Keratinozyten aufgebracht und die Modelle wurden anschließend in einer air-liquid Grenzfläche kultiviert, um die Umgebung der natürlichen Haut zu imitieren. Die Scaffold freien Hautmodelle zeigten eine lange Beständigkeit (49 Tage), wobei das epidermale Kompartiment seinen differenzierten Phänotyp ohne Infiltration in das dermale Kompartiment beibehielt. Aufgrund dieser Robustheit wurden die Hautmodelle zur Nachahmung der Psoriasis (einer unheilbaren, immunvermittelten Entzündungskrankheit) verwendet und klinisch zugelassene Arzneimittel an den Modellen erprobt. Um einen Psoriasis-Phänotyp zu erzeugen, wurden die Hautmodelle mit rekombinantem humanem Interleukin 17A (rhIL-17A) stimuliert. Anschließend wurden die Hautmodelle systematisch mit dem Anti-IL-17A-Antikörper Secukinumab in Gegenwart von rhIL-17A behandelt. Microarray- und RT-PCR-Analysen zeigten, dass die mit rhIL-17A behandelten Hautmodelle eine Herunterregulierung von Differenzierungsmarkern und eine Hochregulierung von Chemokinen und Zytokinen aufwiesen, während die Behandlung mit dem Anti-IL-17A-Antikörper diese Genregulationen umkehrte. Diese Daten bewiesen auf molekularer Ebene die Auswirkungen des Anti-IL-17A-Antikörpers auf die durch rhIL-17A hervorgerufenen Genregulationen. Dies zeigt die physiologische Relevanz des entwickelten Hautmodells und eröffnet Möglichkeiten für seinen Einsatz als Alternative zu Ex-vivo-Hautexplantaten und Tierversuchen. So konnte der gesamte Krankheitsverlauf, vom Auftreten des Krankheitsphänotyps, über die Zugabe des Medikaments bis hin zur anschließenden Wirksamkeit des Medikaments, in vitro nachgeahmt werden. In ähnlicher Weise wurden Langzeitmodelle der Atopischen Dermatitis hergestellt, indem die Hautmodelle mit Interleukin 4 (IL-4) und Interleukin 13 (IL-13) exponiert wurden. Atopische Dermatitis ist eine verbreitete Hauterkrankung, bei der Immuninfiltration und -aktivierung zu Entzündungen, Gefäßveränderungen und einer Störung der Hautbarriere führen. Nach erfolgreicher Herstellung der Dermatitis-Modelle wurde ein gängiges topisches Steroide aufgebracht und die histologischen Veränderungen an den Scaffold freien Krankheitsmodellen beobachtet. Ein weiterer Ansatz zur Verbesserung der Langlebigkeit von im Labor gezüchteten Geweben ist die Versorgung des Gewebes mit Nährstoffen über ein Netzwerk von Blutgefäßen. Die Vaskularisierung ist eine der größten Herausforderungen auf dem Gebiet des Tissue Engineering. Obwohl man annimmt, dass die Vaskularisierung die Langlebigkeit von Hautmodellen durch den Transport von Nährstoffen, Wachstumsfaktoren und Sauerstoff verbessert, sind die Gefäße in In-vitro-Modellen selbst instabil. Das Zusammenwirken verschiedener Zelltypen führt zu Veränderungen im Gefäßsystem, was für die Stabilität der funktionellen Blutgefäße nachteilig sein kann. Hautmodelle bestehen aus menschlichen Fibroblasten und Keratinozyten, die die Blutgefäße in besonderer Weise stimulieren. In ECM-beschichteten Scaffold freien Modellen führte die Zugabe von Keratinozyten zu einer unkontrollierten Angiogenese und der Bildung anormaler Blutgefäße. Nach der Zugabe von Keratinozyten wurde eine gesteigerte Aktivität des vaskulären Wachstumsfaktors (VEGF) und Proteasen beobachtet. Um dies zu verhindern, wurden die Hautmodelle in einem 3D-gedruckten Bioreaktor kultiviert, der das vaskularisierte Hautgewebe kontinuierlich mit Durchfluss versorgt. Die dynamische Flow-Kultur stellte die Gewebehomöostase wieder her, indem sie die Expression von Proteasen und deren Inhibitoren ausglich und die Angiogenese regulierte. Dies führte zu einer Verbesserung der Barriereeigenschaften der Haut, erleichterte die Herstellung von dickerem Gewebe und verbesserte den Wundverschluss. Darüber hinaus begünstigte die vaskularisierte Haut in der Strömungskultur Gefäßöffnungen als durchströmbare Stellen. Zusammenfassend ermöglichte der Bioreaktor, die vaskularisierten Modelle 28 Tage lang mit intakten Blutgefäßen zu kultivieren. ECM-beschichtete Scaffold freie Methoden wurden auch zur Bildung von Krebs-Modellen verwendet, bei denen beschichtete Fibroblasten mit Endothelzellen und Krebszellen gemischt wurden. Hier wurden dreifach negative Brustkrebszellen (MDA-MB231) zur Bildung eines vaskularisierten Tumormodells verwendet. Die Brustkrebs-Zellen zeigten im In-vitro-Gewebe eine stark elongierte Morphologie und führten zu Gefäßanomalien. Die Brustkrebs-Modelle wurden außerdem mit Osteoblasten (knochenbildenden Zellen) ko-kultiviert, um die parakrine Wirkung der Osteoblasten auf das Krebsgewebe zu verstehen, wodurch ein komplexes vierzelliges Tumorprogressionsmodell entstand. Die indirekte Co-Kultur des Gewebes mit Osteoblasten führte zu einer erhöhten Tortuosität der Blutgefäße und zu einer stärkeren Beeinträchtigung der Vaskularität des Brustkrebsgewebes. Allgemein konzentriert sich diese Doktorarbeit auf die Verwendung eines menschlichen Scaffold freien 3D-Modells zur Nachbildung verschiedener Pathologien, von Hautkrankheiten bis hin zu Krebs. Diese Modelle sind in der Lage, langfristig in der Kultur stabil zu bleiben, was eine erweiterte medikamentöse Behandlung und Analyse ermöglichten. In dieser Arbeit werden auch die Veränderungen des Gefäßsystems unter statischen Kulturbedingungen untersucht und die Notwendigkeit dynamischer Flusskulturbedingungen hervorgehoben.

The advancement of tissue engineering techniques has provided an alternate strategy for accessing and predicting the efficacy of novel pharmaceuticals and cosmetics. The urgent need for three-dimensional (3D) organotypic models stems from the limitations of the conventional testing platforms, including two-dimensional (2D) cell monolayers that fail to replicate the intricate architecture of the human tissue and animal models that raise ethical concerns. To compete with these existing pre-clinical platforms, organotypic 3D models need to exhibit longevity and stability. However, most in-vitro studies are conducted for short durations, thereby impeding the understanding of disease progression, long-term influence of the administered drugs/cosmetics, and the consequences of treatment discontinuation. In this thesis, to fabricate 3D human skin tissue models, we employed ECM cell-coating and accumulation technique where individual dermal fibroblast was coated layer-by-layer with fibronectin (FN) and gelatin (G). The coated cells, once accumulated in a confined space, interact with each other to form a scaffold-free 3D tissue. Human keratinocytes were seeded on top of the formed dermis and the models were subsequently cultured in air-liquid interface (ALI) to mimic native skin architecture. The scaffold-free skin models showed long-term durability (49 days) where the epidermal compartment sustained its differentiated phenotype without infiltration of keratinocytes into the dermal compartment. Given this robustness, the skin models were utilized to simulate psoriasis, an incurable, immune-mediated inflammatory disease and a clinically approved drug was tested on the skin models. To induce a psoriasis-like phenotype, the skin models were stimulated with recombinant human interleukin 17A (rhIL-17A). Following stimulation, the skin models were systemically treated with the anti-IL-17A antibody Secukinumab in the presence of rhIL-17A. Microarray and RT-PCR analysis revealed that skin models treated with rhIL-17A showed downregulation of differentiation markers and upregulation of chemokines and cytokines, while treatment with anti-IL-17A antibody reversed these gene regulations. These findings demonstrated, at the molecular level, the effects of anti-IL-17A antibody on rhIL-17A-induced gene regulations, highlighting the physiological relevance of the developed skin model as an alternative to animal experiments. Therefore, the entire course of the disease, from the onset of the disease phenotype to the drug administration and the subsequent drug efficacy, was recapitulated in-vitro. Similarly, in another study, long-term models of atopic dermatitis were established by exposing the skin models to Interleukin 4 (IL-4) and Interleukin 13 (IL-13). Atopic dermatitis is a common skin disease characterized by immune infiltration and activation, resulting in inflammation, vascular changes, and disruption of the skin barrier. Upon successful fabrication of the dermatitis models, a standard topical spheroid was applied and the histological changes were observed on the scaffold-free disease models. Another approach to enhance the longevity of laboratory-cultured tissues involves providing nutrients to the tissue through a network of blood vessels (BV). Vascularization is a prevailing challenge in the field of tissue engineering. Although vascularization is known to improve the longevity of skin models by transporting nutrients, growth factors and oxygen, BV in in-long-term vitro models tend to be inherently unstable. The interplay of different cell types in within the models leads to alterations in the vascular system, which can be detrimental for the long-term stability of the functional BV. Skin models consists of human fibroblasts and keratinocytes that uniquely stimulate the BV. In ECM-coated scaffold-free models, the addition of keratinocytes led to uncontrolled angiogenesis and the formation of abnormal BV. Enhanced vascular growth factor (VEGF) and proteinases activity was observed after the addition of keratinocytes. To prevent this instability, the skin models were cultured within a 3D-printed bioreactor that provided continuous media perfusion to the vascularized skin tissues. Dynamic flow culture restored tissue homeostasis by balancing the expression of proteinase and their inhibitors, and regulating angiogenesis. This led to improvements in skin barrier properties, facilitated the fabrication of thicker tissues, and enhanced wound closure. Furthermore, the vascularized skin in flow culture promoted vascular openings as perfusable sites. In summary, the use of scaffold-free models and the bioreactor enabled the cultivation of the vascularized models with intact BV for a duration of 28-day.ECM-coated scaffold-free methods were also utilized to form vascularized breast cancer models where the ECM-coated fibroblasts were mixed together with endothelial cells and cancer cells. Specifically, triple-negative breast cancer cells (MDA-MB231) were utilized to create the vascularized tumor model. The breast cancer cells exhibited highly elongated morphology within the in-vitro tissue compared to the 2D culture. Within the 3D microenvironment, breast cancer cells led to vascular abnormality, a hallmark of cancer. Furthermore, the breast cancer models were co-cultured with osteoblasts (bone-forming cells) to understand the paracrine effect of osteoblasts on the cancerous tissue, thereby constituting a complex four-cellular tumor progression model. Co-culture with osteoblasts in the presence of cancer cells, led to increased BV tortuosity and impairment. Overall, this doctoral thesis focuses on the utilization of human 3D scaffold-free models to replicate various pathologies, ranging from skin diseases to cancer. These models demonstrate a long-term stability in culture, enabling extended drug treatment and analysis. Furthermore, the thesis investigates the alterations in vasculature in static culture condition and emphasizes on the necessity of dynamic flow culture conditions.

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