Untersuchung verschiedener Ein- und Dreikomponenten-P450-Systeme für die Anwendung in der Biokatalyse

Mertens, Alan; Schallmey, Anett; Schwaneberg, Ulrich

doi:urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-008182

Untersuchung verschiedener Ein- und Dreikomponenten-P450-Systeme für die Anwendung in der Biokatalyse = Investigation of different one- and three-component P450 systems for application in biocatalysis

2015 & 2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Master of Science (M. Sc.), Biotechnology Alan Mertens aus Aachen. Berichter: Universitätsprofessorin Dr. rer. nat. Anett Schallmey Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Ulrich Schwaneberg

ImpressumAachen 2015

Umfang1 Online-Ressource (VII, 262 Seite) : Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen, 2015

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2016

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schallmey, Anett (Thesis advisor) ; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2015-11-05

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-008182
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/567406/files/567406.pdf
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/567406/files/567406.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Cytochrom P450 Monooxygenasen (frei) ; Biokatalyse (frei) ; Elektronentransfer (frei) ; self-sufficient (frei) ; CYP102K1 (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Innerhalb der Doktorarbeit wurde mit Cytochrom P450 Monooxygenasen, einer bedeutenden Biokatalysatorklasse, gearbeitet. P450-Enzyme benötigen Elektronen f$\textrm{ü}$r die Katalyse und können abhängig vom genutzten Elektronentransfersystem in verschiedene Klassen eingeteilt werden. Cytochrom P450 Monooxygenasen, die zu den Dreikomponentensystemen gehören, benötigen Redoxproteine wie Ferredoxine und Ferredoxinreduktasen, während Einkomponenten-P450-Enzyme redox-autark sind und daher keine zusätzlichen Redoxproteine benötigen.Im ersten Teilprojekt wurden putative Elektronentransferproteine aus dem thermophilen Bakterium $\textit{Thermobifida fusca}$ untersucht. Dabei sollten einerseits die natürlichen Elektronentransferpartner von CYP154H1, einer thermostabilen Dreikomponenten-P450 Monooxygenase aus $\textit{T. fusca}$, identifiziert werden. Darüber hinaus sollten auch thermostabile Redoxpartner weiterer Dreikomponenten-P450 Monooxygenasen für deren Einsatz in der Biokatalyse gefunden werden. Dazu wurden zunächst für alle ausgewählten Redoxproteine aus $\textit{T. fusca}$ (fünf Ferredoxine, ein Flavodoxin und vier Ferredoxinreduktasen) geeignete Bedingungen zur löslichen Expression in $\textit{E. coli}$ etabliert. Nach erfolgter Aktivitätsbestimmung wurden die verschiedenen Redoxpartnerkombinationen in Biokatalysen mit CYP154H1, CYP154C5 aus $\textit{Nocardia farcinica}$ und CYP106A2 aus $\textit{Bacillus megaterium}$ eingesetzt. Die Auswertung der Biokatalysen ergab, dass in keinem Fall ein Umsatz erzielt werden konnte, der signifikant höher als der Umsatz der entsprechenden Negativkontrollen ausfiel. Daher kann geschlussfolgert werden, dass sich die natürlichen Elektronentransferpartner für CYP154H1 wahrscheinlich nicht unter den getesteten Proteinen befanden, vorausgesetzt alle getesteten Redoxproteine waren unter den gegebenen Bedingungen korrekt gefaltet und aktiv. Gleichfalls stellte sich heraus, dass die verschiedenen Redoxpartner ebenfalls nicht in der Lage waren, Elektronen auf CYP154C5 und CYP106A2 zu übertragen.Das zweite Teilprojekt dieser Dissertation umfasste die Untersuchung der zu CYP102A1 homologen Einkomponenten-P450 Monooxygenasen CYP102K1 aus dem gram-negativen Bakterium $\textit{Azorhizobium caulinodans}$ sowie CYP102$_{Nmu}$ aus dem gram-positiven Bakterium $\textit{Nakamurella multipartia}$. Die Sequenzidentitäten der Hämdomänen beider Enzyme lagen im Vergleich zur CYP102A1-Hämdomäne jeweils bei unter 40 %. Daher sollte untersucht werden, ob eine solch geringe Sequenzidentität der Hämdomäne ebenfalls ein unterschiedliches Substratspektrum mit sich bringt. Jedoch konnte nur CYP102K1 in löslicher Form heterolog in $\textit{E. coli}$ exprimiert werden, während sämtliche Versuche zur löslichen Expression von CYP102$_{Nmu}$ nicht erfolgreich waren. Von CYP102K1 wurde zusätzlich eine N-terminal verkürzte Variante, N‘-short-CYP102K1, erzeugt und untersucht. Dazu wurde der in CYP102A1 nicht vorhandene 80 Aminosäuren lange Überhang am N-Terminus von CYP102K1 entfernt. Beide CYP102K1-Varianten konnten in guter Ausbeute und hoher Reinheit über IMAC aufgereinigt werden. Im Cytochrom c-Assay zeigten die Varianten eine eindeutige Präferenz für den Cofaktor NADPH gegenüber NADH. Die Untersuchung des Substratspektrums ergab, dass lineare gesättigte Fettsäuren mit einer Kettenlänge von zehn bis fünfzehn Kohlenstoffatomen, die lineare ungesättigte Fettsäure 12-Tridecensäure und β-Jonon geeignete Substrate für CYP102K1 darstellen. Bei Analyse der Fettsäureprodukte wurde eine eindeutige Regioselektivität des Enzyms für die ω-1- bis ω-3-Position ersichtlich. Damit werden interessanterweise, trotz der geringen Sequenzidentität von CYP102K1 und CYP102A1, von beiden P450-Enzymen sehr ähnliche Substrate mit vergleichbarer Regioselektivität umgesetzt. Um das Substratspektrum von CYP102K1 zu erweitern, wurden zusätzlich zwei verschiedene Dicarbonsäuremonoester, Pimelinsäuremonopentyl- und Succinylsäuremonooctylester, mittels Lipasekatalyse im präparativen Maßstab synthetisiert und anschließend in Biokatalysen mit CYP102K1 und N‘-short-CYP102K1 getestet. Dabei konnten in beiden Fällen Produkte nachgewiesen werden, die an der ω-1- und ω-2-Position hydroxyliert wurden, auch wenn die erzielten Umsätze nur relativ gering ausfielen. Abschließend kann festgehalten werden, dass zum ersten Mal Dicarbonsäuremonoester als Substrate für Cytochrom P450 Monooxygenasen der CYP102-Familie eingesetzt und tatsächlich als akzeptierte Substrate nachgewiesen werden konnten. Zudem wurde mit CYP102K1 zum ersten Mal eine zu CYP102A1 homologe Einkomponenten-P450 aus einem gram-negativen Bakterium charakterisiert.

Cytochrome P450 monooxygenases are enzymes of high interest which are applied frequently in biocatalysis because they are able to catalyze hydroxylation reactions and many other reactions. As these enzymes need electrons for catalysis, cytochrome P450 monooxygenases can be grouped into different classes according to the system used for electron transfer. P450 enzymes which belong to three-component systems require redox proteins like ferredoxins and ferredoxin reductases while one-component P450 monooxygenases are redox-self-sufficient and therefore do not depend on additional redox proteins.The first project of this thesis dealt with the investigation of putative electron transfer proteins from the thermophilic bacterium $\textit{Thermobifida fusca}$ in order to identify the native redox partners of CYP154H1, a thermostable three-component P450 monooxygenase. Furthermore, thermostable redox partners for their application in biocatalysis with other three-component P450 monooxygenases should be identified. In the first step, selected redox proteins from $\textit{T. fusca}$ (five ferredoxins, one flavodoxin and four ferredoxin reductases) were recombinantly expressed in $\textit{E. coli}$. After activity determination, a number of redox protein combinations were applied in biocatalysis experiments with several cytochrome P450 monooxygenases (CYP154H1, CYP154C5 from $\textit{Nocardia farcinica}$ and CYP106A2 from $\textit{Bacillus megaterium}$). The data analysis revealed that none of the tested combinations resulted in a conversion which differed significantly from the conversion in the respective negative controls. Under the premise that the natural redox partners for CYP154H1 would have been active and correctly folded, these findings indicate that no natural redox partners were among the tested electron transfer proteins. In addition, the different redox proteins were obviously not capable to transfer electrons to CYP154C5 and CYP106A2 under the applied conditions.The second project of this thesis comprised the investigation of the self-sufficient cytochrome P450 monooxygenases CYP102K1 from the gram-negative bacterium $\textit{Azorhizobium caulinodans}$ and CYP102$_{Nmu}$ from the gram-positive bacterium $\textit{Nakamurella multipartia}$. The heme domain of these enzymes and the heme domain of CYP102A1 (a well-characterized self-sufficient P450) share a sequence identity of less than 40 %. Hence one goal of this project was to investigate whether such low sequence identities are accompanied by different substrate spectra. It was possible to express soluble CYP102K1 recombinantly in $\textit{E. coli}$ while all attempts to achieve soluble expression of CYP102$_{Nmu}$ were not successful. In addition to the full-length protein of CYP102K1, also an N-terminally truncated variant (N‘-short-CYP102K1) was generated by removing the 80 amino acid long tail at the N-terminus of CYP102K1, which is not present in CYP102A1. Both CYP102K1 variants were produced and purified in sufficient yields and NADPH was found to be the preferred cofactor in both cases. Investigations of the substrate spectrum revealed that linear saturated fatty acids with a chain length of ten to fifteen C-atoms represent suitable substrates for the CYP102K1 variants. The product analysis disclosed a distinct regioselectivity of the CYP102K1 variants towards the ω-1- to ω-3-position. Interestingly, this shows that CYP102K1 and CYP102A1 convert similar substrates with comparable regioselectivity despite their low sequence identity. In order to extend the substrate spectrum of CYP102K1, two different dicarboxylic acid monoesters (pimelic acid monopentylester and succinic acid monooctylester) were synthesized in preparative scale using the lipase CalB. These esters were applied as potential substrates in bioconversion experiments using CYP102K1. Indeed for both compounds product formation was detected although the conversion was rather low. Finally, it can be concluded that with the characterization of CYP102K1 for the first time the experimental investigation of a self-sufficient CYP102 enzyme from a gram-negative bacterium was successful.

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