Generation of a panel of Plasmodium falciparum apical membrane antigen 1-specific human monoclonal antibodies by phage display chain shuffling

Seidel, Melanie; Fischer, Rainer; Wnendt, Stephan

doi:HT019188850

Generation of a panel of Plasmodium falciparum apical membrane antigen 1-specific human monoclonal antibodies by phage display chain shuffling = Generierung einer Palette von Plasmodium falciparum Apikales Membranantigen 1-spezifischen humanen monoklonalen Antikörpern mittels Phage Display-"Chain Shuffling"

Seidel, Melanie

2016 & 2017

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Diplom-Biologin Melanie Seidel

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (X, 146 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2017

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)^RWTH* ; Wnendt, Stephan (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-12-12

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-114488
DOI: 10.18154/RWTH-2016-11448
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/679863/files/679863.pdf
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/679863/files/679863.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
malaria (frei) ; antibodies (frei) ; plasmodium (frei) ; phage display (frei) ; affinity maturation (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Plasmodium falciparum, der Erreger der Malaria tropica ist bis heute einer der bedeutendsten Ursachen für weltweite Morbidität und Mortalität. Auftretende Resistenzen gegen Malaria-Medikamente verlangen nach neuartigen Therapeutika und Therapiestrategien. Die Benutzung von Anti-Malaria-Antikörpern wurde als Alternative für anderweitig nicht therapierbare Patienten oder zur Prophylaxe von Reisenden diskutiert, da Antikörper bekanntermaßen maßgeblich zur natürlich erworbenen Immunität gegen Malaria beitragen. Trotz des Fortschritts im Bereich der Malaria-Vakzinforschung, welcher kürzlich mit der Zulassung des Vakzinkandidaten RTS,S/AS01 erreicht wurde, sind effektivere Vakzine der zweiten Generation nötig. Für das sinnvolle Design solcher Vakzine ist ein klares Verständnis der Malaria-Immunität notwendig. Die Studie von entsprechenden monoklonalen Anti-Malaria-Antikörpern gibt wichtige Einblicke in die zugrundeliegenden Mechanismen. Zu diesem Zweck wurde hier ein parasitenwachstumsinhibierender humaner monoklonaler Antikörper, der gegen das polymorphe, asexuelle Blutstadiums-Protein „Apical membrane antigen 1“ (AMA1) aus P. falciparum gerichtet ist, einem „Phage Display Chain shuffling” unterzogen und die resultierenden Antikörper charakterisiert. Für das „Light chain shuffling“ wurden- Phage Display- Antikörperbibliotheken unter der Benutzung von cDNA, die aus der totalen RNA von peripherem Blut von 50 malaria-immunen ghanaischen Donoren stammte, in zwei verschiedenen Phagemidsystemen konstruiert. Das Phage Display „Bio-Panning“ beider Bibliotheken wurde gegen eine Mischung dreier diversitätsabdeckender AMA1-Varianten, DiCo1-3, unter Benutzung zweier Arten von Helferphagen durchgeführt und führte zur Anreicherung von vier „leichten Ketten“. Die „geshuffelten“Antikörper wurden transient im IgG1-Format in Nicotiana benthamiana exprimiert, wobei sie im Vergleich zu OcheA bis zu 73-fach erhöhte Akkumulationslevel erreichten. Die Spezifität der Antikörper konnte durch Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) und Immunfluoreszenz Assays (IFA) bestätigt werden. Die Affinitäten zu verschiedenen AMA1-Varianten wurden durch Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie bestimmt, wobei eine 12-fache Verbesserung der Affinität des höchstaffinen Antikörpers gegen DiCo3 gezeigt wurde. Eine inhibitorische Aktivität der Antikörper wurde in vitro mittels Wachstumsinhibitions-Assay (GIA) gegen vier P. falciparum-Stämme bestätigt. Anschließend wurden zwei Antikörper für ein „Heavy Chain- Shuffling“ ausgewählt und die entsprechenden Bibliotheken in pFlx konsturiert. Nach zwei Panningrunden gegen DiCo1 oder DiCo1-3 wurde eine Anreicherung höchst homologer schwerer Ketten, deren Allel dem V-Gen Allel der parentalen schweren Kette entsprach, beobachtet. Einige der elf identifizierten homologen Antikörper wurden mit vergleichbar hohen Akkumulationsraten zwischen 280 und 730 mg/kg Blatt-Frischgewicht transient in N. benthamiana exprimiert. Eine weitere bis zu 21-fache Erhöhung der Affinität konnte experimentell auf einen CDR2-Rest der schweren Kette zurückgeführt werden. Zwei Antikörper, E-9 und F-17B, wurden weitergehend charakterisiert. Die Spezifität gegen mehrere rekombinante AMA1-Varianten wurde durch ELISA bestätigt, während die kreuzreaktive spezifische Erkennung von parasiten-exprimiertem AMA1 gegen fünf P. falciparum- Stämme mittels IFA demonstriert wurde. AMA1-Bindungsinterferenzen aller „chain-geshuffelten“ Antikörper als auch mit AMA1-Antikörper 4G2 deuteten auf überlappende Epitope hin. Mittels konformationsabhängiger Epitopkartierung unter Benutzung des repräsentativen Antikörpers F-17B und Antigen AMA1 3D7 wurde ein α- helikales, 13 Aminosäuren langes Epitop an der Schnittstelle von AMA1 Domäne I und II identifiziert, welches zwei polymorphe Reste aufwies. Eine stammumfassende wachstumsinhibitorische Aktivität gegen sieben verschiedene P. falciparum- Stämme mit einer minimalen EC50 von 0,25 mg/mL wurde mittels GIA gezeigt. Laut dem Loewe-Additivitäts-Modell wurde ein Synergismus des „heavy chain- geshuffelten“ Antikörper E-9 mit AMA1- Antikörper 1E4 im GIA festgestellt. Es ist zu erwarten, dass sich die hier generierte Reihe homologer, wachstumsinhibitorischer, humaner, monoklonaler Antikörper als wertvoll für die Aufklärung von Mechanismen der Wachstumsinhibition und der Malaria-Immunität erweisen wird. Dieses Wissen ist von großer Bedeutung für die zielgerichtete Entwicklung von therapeutischen monoklonalen Antikörpern als auch Vakzinen der nächsten Generation. Außerdem besitzen die „ketten-geshuffelten“ Antikörper ein therapeutisches Potential gegen P. falciparum-Malaria, das durch weitere zielgerichtete Affinitätsreifung, zusätzliche Modifikationen und sinnvolle Kombination mit weiteren inhibitorischen Antikörpern noch verbessert werden könnte.

Plasmodium falciparum which causes malaria tropica, still remains one of the most important causes of morbidity and mortality worldwide. Emerging resistances against anti-malarial drugs make novel therapeutic agents and strategies necessary. Antimalarial antibodies have been discussed as alternative therapy for otherwise non-treatable patients or prophylaxis for travelers as it is known that antibodies substantially contribute to natural acquired immunity against malaria. Despite the progress in the field of malaria vaccine development that has recently been achieved with the approval of vaccine candidate RTS,S/AS01, more effective second-generation vaccines are required. For the rational design of such vaccines, a clear understanding of protective malaria immunity is required. The study of antimalarial monoclonal antibodies gives important insight into the underlying mechanisms. For this purpose, a parasite growth inhibitory human monoclonal antibody (OcheA) directed against the polymorphic P. falciparum asexual blood-stage protein, apical membrane antigen 1 (AMA1), was subjected to phage display mediated chain shuffling and the resulting antibodies were characterized. Chain shuffling was chosen as a tool for in vitro affinity maturation. Light chain shuffling phage display antibody libraries were constructed in two different phagemids, pRF and pFlx, using cDNA derived from peripheral blood total RNA of 50 malaria immune Ghanaian donors. Phage display bio-panning of both libraries against a mix of three diversity-covering AMA1 variants, DiCo1-3, using two types of packaging phages, led to the enrichment of four light chains. The shuffled antibodies were transiently expressed in the IgG1 format in Nicotiana benthamiana, achieving up to 73-fold improved accumulation levels compared to OcheA. The specificity of the antibodies could be confirmed by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and immunofluorescence assay (IFA) whilst the affinity to different AMA1 variants was determined by surface plasmon resonance spectroscopy, showing a 12-fold improved affinity of the highest affinity antibody against DiCo3. An inhibitory activity of the antibodies was confirmed using in vitro growth inhibition assays (GIA) against four P. falciparum strains. Subsequently, two antibodies were selected for heavy chain shuffling and the libraries were constructed in phagemid pFlx. After two rounds of panning against DiCo 1 or DiCo1-3 an enrichment of highly homologous heavy chains of the same V gene allele as the parental heavy chain was observed. Several of the 11 identified homologous antibodies were transiently expressed in N. benthamiana at comparably high accumulation levels in the range of 280 to 730 mg/kg fresh leaf mass. A further up to 21-fold increase of affinity (to 240 pM) could be experimentally traced back to a heavy chain CDR2 residue. For two selected antibodies, E-9 and F-17B, specificity against several recombinant AMA1 variants was confirmed by ELISA while the cross-strain specific recognition of parasite expressed AMA1 was demonstrated by IFA against five P. falciparum strains. AMA1 binding interference with all chain shuffled antibodies as well as with anti-AMA1-antibody 4G2 suggested overlapping epitopes. By conformational epitope mapping using representative antibody F-17B and AMA1 3D7, an α-helical 13 amino acid epitope at the interface of AMA1 domain I and II, containing two polymorphic residues, was identified. Strain-spanning growth inhibitory activities against seven P. falciparum strains with minimal EC50 values of 0.25 mg/mL were determined by GIA. According to Loewe additivity, a synergistic interaction of heavy chain shuffled antibody E-9 with anti-AMA1 antibody 1E4 in GIA was suggested. The here generated panel of homologous growth inhibitory human monoclonal antibodies is expected to prove valuable for elucidating mechanisms of growth inhibition and protective malaria immunity. This knowledge is highly important for the targeted development of therapeutic monoclonal antibodies and next-generation vaccines.Moreover, the chain shuffled antibodies possess a therapeutic potential against P. falciparum malaria, which might be improved by further targeted affinity maturation, additional modifications, and reasonable combination with other inhibitory antibodies.

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