Process development, analysis and improvement for biphasic oxidoreductions on miniplant scale

Begemann, Jens; Büchs, Jochen; Pich, Andrij; Spieß, Antje

doi:36002

Process development, analysis and improvement for biphasic oxidoreductions on miniplant scale = Prozessentwicklung, -analyse und -optimierung für zweiphasige Oxidoreduktionen im Pilotmaßstab

Begemann, Jens

2017

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Jens Begemann

ImpressumAachen 2017

Umfang1 Online-Ressource (XII, 114 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2017

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Spieß, Antje (Thesis advisor) ; Büchs, Jochen (Thesis advisor)^RWTH* ; Pich, Andrij (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2017-03-15

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2017-03451
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/687845/files/687845.pdf
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/687845/files/687845.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Lehrstuhl für Enzymprozesstechnik (420110)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
oxidoreductions (frei) ; biphasic biocatalysis (frei) ; organic solvents (frei) ; hydrogels (frei) ; process model (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Für die biokatalytische Umsetzung schlecht wasserlöslicher Substrate ist der Einsatz von unpolaren Lösungsmitteln in einem wässrig/organischen Zweiphasensystem eine mögliche Lösung. Das Substrat kann in hohen Konzentrationen in der organischen Bulkphase gelöst werden und diffundiert, mit dem jeweiligen Verteilungsgleichgewicht als Triebkraft, in die wässrige Phase, wo die Umsetzung erfolgt. Hierbei können Hydrogele die eingesetzten Enzyme vor Deaktivierung an der Phasengrenzfläche und vor hydromechanischer Belastung schützen. Die Reduktion von Acetophenon, katalysiert durch die Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis (CPCR2) bzw. die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis (LbADH G37D) ist eine modellhafte Reaktion zum Umsatz hydrophober Substrate. Cofaktorregeneration erfolgte durch Oxidation von Ameisensäure, via Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii (FDH). Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zwei Möglichkeiten der Prozessführung zu untersuchen, die es ermöglichen, die Oxidoreduktionsreaktion über einen langen Zeitraum aufrecht zu erhalten und den durch die Oxidation von Ameisensäure ansteigenden pH-Wert zu stabilisieren. Des Weiteren wurden die Bereitstellung ausreichender Enzymmengen und die Identifizierung und Einführung geeigneter Immobilisierungstechniken untersucht. Um alternative Methoden für die Immobilisierung von Enzymen in Hydrogelen zu ermitteln, sollten CPCR2 und FDH in unterschiedlichen Verfahren immobilisiert werden. Die Immobilisierung in mit Glutaraldehyd GA vernetztem Polyallylamin (PA) konnte für die CPCR erfolgreich durchgeführt werden. Mit Methylen-bis-Acrylamid (BIS) vernetzes Poly-N-Isopropylacrylamid (PNIPAAm) zeigte lediglich für die FDH restaktivitäten. Für die Immobilisierung der Enzyme in definierten Polyvinylalkohol (PVA)-Hydrogelkugeln musste zuerst ein bestehendes Protokoll zur Kryogelierung für die Anforderungen der vorliegenden Arbeit etabliert und charakterisiert werden. Für die Reduktion von Acetophenon in einem hydrogelstabilisierten wässrig/organischen Zweiphasensystem wurde ein auf der Basis einer CO2-Messung geregelter Prozess entwickelt. Mit einem holistischen Prozessmodell wurden Simulationsstudien durchgeführt, um für eine rationale Prozessoptimierung Potenziale und Limitationen aufzuzeigen. Da die Messung von CO2 in einem wässrig/organischen Zweiphasensystem aufgrund der guten Löslichkeit von CO2 in organischen Lösungsmitteln - besonders bei hohen Umsatz-geschwindigkeiten - zu einem Zeitversatz der CO2-Messung und damit zu einem temporären Anstieg des pH-Wertes führte, sollte eine direktere Methode zur Bestimmung des pH-Wertes als Basis der Prozessregelung entwickelt werden. Hierfür wurde Dual Lifetime Referencing (DLR) herangezogen. Ein experimenteller Konzeptnachweis konnte die Reaktion auf einem stabilen pH-Wert halten und die Produktausbeute gegenüber der CO2-geregelten Reaktion erhöhen. Neben der Identifizierung interessanter Ansätze der Immobilisierung von Enzymen in Hydrogelen für die Anwendung in wässrig/organischen Zweiphasensystemen - wenn auch mit Potential für Optimierungen - konnte gezeigt werden, dass beide vorgestellten Prozesskonzepte vielversprechende Alternativen für geregelte, biokatalytische Prozesse in Zweiphasensystemen darstellen und modellgestützte Prozessanalysen kritische Punkte und Optimierungspotential aufzeigen können.

The biocatalytic conversion of hydrophobic substrates indicates the application of nonpolar solvents in an aqueous/organic two phase system. The substrate can be dissolved in high concentrations within the organic bulk phase and diffuses, according to the partition equilibrium into the aqueous phase, where it is converted. A hydrogel-stabilized aqueous phase is capable of protecting the enzymes from surface deactivation and hydrodynamic stress. The reduction of acetophenone catalyzed by the carbonyl reductase from Candida parapsilosis (CPCR2) and the alcohol dehydrogenase from Lactobacillus brevis (LbADH G37D) is a model reaction for the conversion of hydrophobic substrates. The co-factor NADH is regenerated in situ by oxidizing formic acid, catalyzed by formate dehydrogenase from Candida boidinii (FDH). Aim of this work was to develop, establish and analyze options for process control, enabling stable oxidoreductions without pH-increase by oxidized formic acid. Further, the prerequisites for establishing the two processes, a reliable enzyme supply and an appropriate immobilization technique were addressed. In order to discover alternative methods to cryo-gelation of polyvinylic alcohol (PVA) for the hydrogel entrapment of enzymes, due to low residual activities obtained for CPCR2 and FDH and limited protein capacity, CPCR2 and FDH were immobilized by different methods. The immobilization within glutaraldehyde-cross-linked polyallylamine (PAAm) was applied successfully. Methylene-bis-acrylamide-(BIS)-cross-linked poly-N-isopropyl amide (PNIPAAm) only lead to a residual activity of FDH. An existing method for cryo-gelation of PVA for immobilization of enzymes within defined (PVA) hydrogel beads was adapted, established and characterized for the application within this work. A controlled process in a two phase reaction system was developed for the reduction of the hydrophobic model substrate acetophenone dissolved in n-heptane to 1-phenylethanol catalyzed by CPCR2, immobilized in a PVA hydrogel. After an experimental proof of the process concept, simulation studies with a holistic process model were performed in order to identify limitations for a rational improvement and to point out the potential of the process. As the measurement of CO2 produced during co-factor regeneration occurs time shifted, depending on the CO2 solubility within the immobilisates and the organic bulk phase, volume of the CO2-sink, temperature and CO2 concentrations within the dissolving phases, a more direct measurement technique, especially for high reaction rates, is indicated. To this end, dual lifetime referencing (DLR), a fluorescence spectroscopic method, was applied for online-monitoring of the pH-value within the immobilisates during the reaction, allowing a controlled dosage of formic acid. An experimental proof of concept could maintain a reaction, resulting in an increased substrate conversion, compared to the CO2-based control. In addition to the identification of promising immobilization techniques for application in aqueous/organic two phase systems, although with potential for optimization, it was shown that the two described process concepts constitute promising alternatives for controlled, biocatalytic, biphasic processes and model based process analysis can help revealing critical aspects and optimization potential.

OpenAccess:
PDF PDF (PDFA)
(additional files)