Confocal single molecule FRET studies of surface immobilized biomolecules

Albarghash, Alyazan; Fitter, Jörg Ludwig; von Plessen, Gero

doi:10.18154/RWTH-2018-231924

Confocal single molecule FRET studies of surface immobilized biomolecules

Albarghash, Alyazan^RWTH*

2018 & 2019

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Alyazan Albarghash

ImpressumAachen 2018

Umfang1 Online-Ressource (x, 136 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2018

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2019

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fitter, Jörg Ludwig (Thesis advisor)^RWTH* ; von Plessen, Gero (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2018-07-04

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2018-231924
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/752187/files/752187.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biomolecules (frei) ; DNA (frei) ; Einzelmolekül (frei) ; FRET (frei) ; Fluorezenz (frei) ; Konfokalmikroskopie (frei) ; Konfokalspektroskopie (frei) ; Phosphoglyceratkinase (PGK) (frei) ; confocal microscopy (frei) ; fluorescence (frei) ; single molecule (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 530

Kurzfassung
Einzelmolekül-FRET ist eine leistungsfähige, vielseitige Methode, die neben der Strukturbestimmung von biologischen Makromolekülen auch die Beobachtung der molekularen Konformationsdynamik ermöglicht. Sie liefert wertvolle Erkenntnisse, die unser Verständnis von Faltungsphänomenen und anderen biologischen Prozessen wie der Ligandenbindungskinetik verbessern. FRET kann mit frei in Lösung diffundierenden Molekülen durchgeführt werden. Dabei liegen die die Beobachtungszeiten typischerweise im Millisekundenbereich beschränkt durch die kurze Verweilzeit der thermisch durch das Detektionsvolumen getriebenen Moleküle. Um die Beobachtungszeit von FRET-Messungen zu verlängern, ist die Immobilisierung der Moleküle auf funktionalmodifizierten Oberflächen ein gut etabliertes Verfahren. In dieser Arbeit wird ein verbessertes Protokoll zur Oberflächenimmobilisierung basierend auf dem Biotin-Neutravidin-Bindungsassay vorgestellt. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Einzelmolekül-FRET-Messungen unter verschiedenen Bedingungen durchzuführen. Die Beobachtungszeit der verankerten Moleküle ist dabei durch die Photostabilität der gewählten Fluorophore begrenzt. Daher wurden die photophysikalischen Eigenschaften der Fluorophore Alexa488 und Alexa647, die in dieser Arbeit als FRET-Paar ausgewählt wurden, untersucht. Die Auswirkung verschiedener Klassen von sogenannten Photoprotektionsadditive auf das photophysikalische Verhalten des gewählten FRET-Paares wurde in Bezug auf die Emissionslebensdauer und Signalstabilität untersucht. Ein Protokoll zur Verbesserung der FRET-Paar-Photostabilität in wässrigen Puffern, auch in Gegenwart von Denaturierungsmitteln wurde etabliert. Zwei verschiedene starre, doppelsträngige DNA-Oligonukleotiden mit definierten Abständen zwischen den Farbstoffbindepositionen wurden als Modellsystem für einstufiges FRET verwendet, um die Wirkung der angepassten experimentellen Bedingungen auf die Ergebnisse der FRET-Messung zu untersuchen. Zusätzlich wurde dynamisches FRET am Beispiel der Phosphoglyceratkinase (PGK) in nativen Zustand und in Gegenwart des Denaturierungsmittel Guanidinhydrochlorid (GdnHCl) untersucht. Die FRET-Messungen wurden mit einer konfokalen Mikroskopie-Anlage durchgeführt, welche die Auflösung der Fluoreszenzlebensdauern und so die genaue Bestimmung der FRET-Effizienzen ermöglicht. Die Ergebnisse der Fluoreszenzlebensdaueranalyse trugen entscheidend zum Verständnis der FRET-Prozesse sowie der damit verbundenen photophysikalischen Phänomene bei. Die Kalibrierungsparameter, welche für die verschiedenen Detektionseffizienzen der verschiedenen Detektionskanälen korrigieren, wurden für die jeweiligen experimentellen Bedingungen genau bestimmt. Schließlich zeigte die Fluoreszenzlebensdaueranalyse der Donoremission nach Photobleichen des Akzeptors die Existenz zweier möglicher Dunkelzustände des Akzeptors, von denen einer Löschwirkung auf den Donor entfaltet.

Single-molecule FRET is a powerful, versatile method with widely opened frontiers going further beyond structure determination of biological macro molecules. Indeed, it facilitates monitoring molecular conformational dynamics, providing valuable knowledge that enhances our understanding of folding phenomena and other biological processes such as ligand binding kinetics. FRET can be performed in-solution on freely diffusing molecules with observation times limited to the short dwell time of the molecules thermally driven through the detection volume, typically in the millisecond regime. Alternatively, anchoring of molecules of interest to a functionally modified surface is a well-established technique to facilitate extended observation time of FRET measurements. In this work, an improved protocol of surface immobilization based on biotin-neutravidin binding assay is presented. This protocol is further employed to achieve FRET measurements on biological molecules at the single molecule level under various conditions. Once the molecules are successfully tethered on-surface, FRET observation of labeled biomolecules is then limited by the photostability of the elected fluorophores. Therefore, the photophysical properties of the Alexa488 and Alexa647 fluorophores, elected to be the FRET-pair in this work, are studied. The effect of various classes of the so-called photoprotection additives on the photophysical behavior of the elected FRET-pair is investigated in terms of emission longevity and signal stability. A protocol for the enhancement of the FRET-pair photostability in aqueous buffers, as well as, under application of denaturants is introduced. Two variants of structurally rigid double-stranded DNA oligonucleotides, with defined inter-dye distances are employed as a model system to investigate the effect of the adjusted experimental conditions on the output of the FRET measurement. On the other hand, Phosphoglycerate Kinase (PGK) is studied in a native condition and under application of guanidine hydrochloride (GdnHCl) denaturant at 0.7 M concentration. The FRET measurements are achieved with a confocal microscopy setup that facilitates resolving fluorescence lifetimes. The advantageous temporal resolution of the employed confocal setup enabled utilizing the fluorescence lifetime analysis for accurate determination of FRET efficiencies. The results of the fluorescence lifetime analysis crucially contributed to a thorough understanding of the FRET processes, as well as the associated photophysical phenomena. Consequently, the necessary calibration parameters which correct for the different detection efficiencies in different detection channels are accurately determined for each experimental condition. The observation and the analysis of one-level FRET from each of the DNA variants, exhibiting either high or low FRET, in addition to dynamical FRET from PGK are presented in this work. Additionally, FRET measurements facilitating the observation of PGK unfolding under the application of 0.7 M GdnHCl are also presented. Finally, the fluorescence lifetime analysis of donor's emission after acceptor's photobleaching revealed the existence of two possible dark-states of the acceptor, of which one exhibits a quenching effect on the donor.

OpenAccess:
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