Robotic high-throughput screening for the optimization and prediction of recombinant protein expression in microscale

Mühlmann, Martina Julia; Büchs, Jochen; Kremling, Andreas

doi:10.18154/RWTH-2019-00834

Robotic high-throughput screening for the optimization and prediction of recombinant protein expression in microscale = Automatisiertes Hochdurchsatzscreening zur Optimierung und Vorhersage der rekombinanten Proteinexpression im Mikromaßstab

Mühlmann, Martina Julia^RWTH*

2018 & 2019

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Martina Julia Mühlmann

ImpressumAachen 2018

Umfang1 Online-Ressource (XII, 123 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2018

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2019

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Büchs, Jochen (Thesis advisor)^RWTH* ; Kremling, Andreas (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2018-12-07

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2019-00834
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/753723/files/753723.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (416510)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
BioLector (frei) ; E. coli (frei) ; high-throughput screening (frei) ; microtiter plate (frei) ; online monitoring (frei) ; oxygen transfer rate (frei) ; recombinant protein (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Im Rahmen dieser Arbeit wurden sowohl Methoden für ein reproduzierbares Klonscreening, als auch Methoden zur Erhöhung und Vorhersage der rekombinanten Proteinproduktion in Escherichia coli entwickelt. Automatisierte Hochdurchsatzscreenings mit kombinierbaren Modulen aus Upstream- und Downstreamprozessen konnten realisiert werden. Dabei wurde sowohl nach optimierten Stämmen gescreent, als auch nach optimierten Kultivierungs- und Induktionsbedingungen. Als Basis diente eine Roboterplattform (RoboLector), die neben einem Liquid Handling Systemzusätzlich mit einem BioLector ausgestattet ist. Standardprozeduren für die manuelle Medienpräparation, Zelllyse, Proteinquantifizierung, Detektion von Enzymaktivität und Probenahme wurden auf automatisierbare Protokolle transferiert. Viele Parameter beeinflussen die rekombinante Proteinexpression. In dieser Arbeit wurden die Temperatur, die Induktorkonzentration und der Induktionszeitpunkt genauer untersucht. Mithilfe des RoboLectors wurden Induktionsprofile in 48-Well Flowerplates erstellt und zudem mit Schüttelkolben Experimenten in der RAMOS (Respiration Activity Monitoring System) Anlage verglichen. Es zeigte sich sowohl in den Daten der Biomasse, als auch in den Daten der Sauerstofftransferraten (oxygen transfer rate - OTR), dass der Metabolismus durch die Induktion mit dem Lactose-Analogon Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) bei hohen Temperaturen deutlich stärker belastet war, als bei geringen Temperaturen. Außerdem reichten bereits geringe Induktorkonzentrationen (0.5 - 0.1 mM IPTG) aus, um eine hohe Produktbildung zu erzielen. OTR Daten liefern viele Information über den metabolischen Zustand einer Kultur. Bisher ist die Messung in Mikrotiterplatten in kommerziell verfügbaren Geräten aber nicht möglich. Die sichtbaren Zusammenhänge von OTR und Biomasse-basiertem Streulicht wurden deshalb im Rahmen der Arbeit genauer untersucht. Für E. coli konnte gezeigt werden, dass die erste Ableitung der Streulichtverläufe proportional zu den OTR Verläufen ist. Die Streulichtdatenkönnen somit in vielen Fällen zur Interpretation von physiologischen Zuständen dienen. Die Nicotinamidadenindinukleotid (NADH) Fluoreszenz der Zellen konnte als zusätzliches Signal für die metabolische Belastung identifiziert werden. Zudem wurden zwei verschiedene Ansätze zur Vorhersage der rekombinanten Proteinbildung entwickelt. Aufwändige Analysetests sind für eine erste Abschätzung nicht mehr notwendig.

The aim of this work was to develop methods for a reproducible clone screening as well as methods to increase and predict recombinant protein production in Escherichia coli. Automated high-throughput screenings (HTS) with combinable modules from upstream and downstream processes were realized. It was screened for optimized strains as well as for optimized cultivation and induction conditions. Therefore, a robotic platform (RoboLector), which is equipped with a liquid handling system and a BioLector, was applied. Standard procedures for manual media preparation, cell lysis, protein quantification, enzyme activity detection and sampling have been transferred to automatable protocols. Many parameters affect the recombinant protein expression. In this work, temperature, inducer concentration, and induction time were investigated in more detail due to the lack of broad studies. With the help of the RoboLector, induction profiling was carried out at temperatures of28°C - 37°C in 48-well Flowerplates. Data were additionally compared with shake flask experiments in the RAMOS (Respiration Activity Monitoring System) device. Both, the biomass measurements and the oxygen transfer rate (OTR) data, indicated a stronger metabolic burden from induction at high temperatures than at low temperatures. In addition, even low inducer concentrations (0.5 - 0.1 mM IPTG) were sufficient to achieve high product formation. OTR data provide a lot of information about the metabolic state of a culture. So far, the measurement of OTR in microtiter plates is not possible in commercially available devices. Therefore, the recognized correlations between OTR and biomass-based scattered light were examined in more detail in the context of this work. The first derivative of the scattered light course revealed to be proportional to the OTR trend for E. coli. Thus, the scattered light data can serve for the interpretation of physiological states in many cases. The nictotinamide adeninedinucleotide (NADH) fluorescence of the cells could be identified as an additional signal for metabolic burden. Moreover, two different approaches to predict recombinant protein formation have been developed.

OpenAccess:
PDF
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