Genome based investigations towards understanding carbon source dependent bioelectrochemical activity of Pseudomonas aeruginosa strains

Berger, Carola; Blank, Lars M.; Agler-Rosenbaum, Miriam

doi:10.18154/RWTH-2019-06750

Genome based investigations towards understanding carbon source dependent bioelectrochemical activity of Pseudomonas aeruginosa strains

Berger, Carola^RWTH*

2019

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von M.Sc. Mikrobiologie und Biochemie Carola Berger

ImpressumAachen 2019

Umfang1 Online-Ressource (XVI, 205, A37 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Agler-Rosenbaum, Miriam (Thesis advisor) ; Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2019-02-13

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2019-06750
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/764301/files/764301.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
DNA Sequenzierung (frei) ; DNA sequencing (frei) ; P. aeruginosa (frei) ; Phenazine (frei) ; Transcriptom Analyse (frei) ; bioelectrochemical system (frei) ; bioelectrochemisches System (frei) ; genomic island (frei) ; genomische Inseln (frei) ; phenazines (frei) ; transcriptome analysis (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das ubiquitär verbreitet Bakterium Pseudomonas aeruginosa ist in der Lage, elektrischen Strom in bioelektrochemischen Systemen (BES) zu erzeugen. Hierbei wird der Elektronentransport zur Anode durch zelleigene redoxaktive Mediatoren, die so genannten Phenazine, ermöglicht. Die Bildung dieser farbigen Moleküle gehört zu den charakteristischen Eigenschaften von P. aeruginosa. Bei ausreichender Konzentration können sie auch mit bloßem Auge auf Festmedien und in Submerskulturen wahrgenommen werden. Während der Stammhaltung von P. aeruginosa PA14 sekretierten einige Kolonien deutlich reduzierte Mengen an Phenazinen. In Abhängigkeit von der genutzten Kohlenstoffquelle zeigte jenes Isolat ein stark verändertes Zeitprofil oder eine signifikant reduzierte Phenazin-Biosynthese und damit einhergehende Veränderung der Stromgeneration. Sequenzierung beider Kolonieformen ergab eine Deletion von zwei Basenpaaren im LasR kodierenden Gen des Stammes, welcher die geringeren Mengen an Phenazinen produzierte. LasR dient im komplexen quorum sensing (QS) System von P. aeruginosa als übergeordneter Regulator, welcher die Expression einer Vielzahl von Genen direkt oder indirekt beeinflusst. Zu diesen Zielen gehören auch die Operons der Phenazin-Biosynthese. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die kohlenstoffquellenabhängige, veränderte Phenazin- und Stromproduktion der beiden Phänotypen mit der lasR Expression korreliert und erklärt werden kann. Zudem legen die vorgestellten Ergebnisse eine lasR abhängige Signalverknüpfung zwischen 2,3-Butandiol (2,3-BD) und dem QS Regulationssystem nahe. Neben der verwendeten Kohlenstoffquelle hat auch der eingesetzte P. aeruginosa Stamm einen großen Einfluss auf die Fähigkeit zur Stromerzeugung in einem BES. Um besser verstehen zu können, was das, aus einem BES stammende, Umweltisolat KRP1 zu einem herausragenden Kandidaten für weiterführende Forschung auf dem Gebiet der mikrobiellen Brennstoffzellen macht, wurde sein Gesamtgenom sequenziert und im Detail analysiert. Im Zuge dieser Analyse konnte die zuvor fragliche Zugehörigkeit des Stammes zu der Art P. aeruginosa eindeutig bestätigt werden. Zudem wurde die Organisation des KRP1 Genoms im Hinblick auf das Vorkommen genomischer Inseln untersucht. Diese sind Abschnitte der DNS, welche nicht allen Mitgliedern der Spezies P. aeruginosa gemein sind. Durch Nutzung verschiedener bioinformatischer Programme konnten 18 solcher Inseln identifiziert werden, deren addierte Länge ca. 10% des Gesamtgenoms ausmacht. Viele der Inseln wurden, zumindest in Teilen, bereits in anderen sequenzierten P. aeruginosa Stämmen gefunden. So enthält KRP1 unter anderem alle genomischen Inseln, die zuvor im hochvirulenten PSE9 Stamm nachgewiesen wurden. Des Weiteren wurden viele Inseln gefunden, die für die erhöhte Virulenz des Liverpool Epidemic Strain (LES) verantwortlich gemacht werden. Diese Funde legen die Schlussfolgerung nahe, dass es sich bei dem BES-Isolat KRP1 selbst um einen hochvirulenten P. aeruginosa Stamm handelt. Die in dieser Arbeit erzeugten Genomsequenzen der Stämme PA14 und KRP1 bildeten eine ideale Grundlage für die weiterführende Untersuchung des regulatorischen Netzwerks zur Erforschung der Ursachen der zuvor gezeigten Abhängigkeit der Stromerzeugung von Stamm und Kohlenstoffquelle. Um einen möglichst umfassenden Einblick in die zusammenhängenden Stoffwechselwege zu gewinnen, wurde eine Untersuchung des Gesamt-Transkriptoms gewählt. Für beide Stämme wurden jeweils individuelle RNA Sequenzierungen für planktonische und aus Biofilm entnommene BES Zellen, die unter Nutzung von jeweils 2,3-BD oder Glukose als Kohlenstoffquelle gewachsen sind, vorgenommen. Durch die Erstellung eigener Bibliotheken für jeden Stamm, jede Subpopulation und jede Kohlenstoffquelle, konnten verschiedene Sätze differentieller Genexpressionsvergleichsanalysen durchgeführt werden. Damit war es möglich, durch Nutzung unterschiedlicher Kohlenstoffquellen ausgelöste Effekte von jenen zu unterscheiden, welche durch die unterschiedlichen Wachstumsstile verursacht werden. Die Transkriptionsdaten dieser Arbeit zeigen unter anderem, dass der im oberen Bereich des Bioreaktors, an der Grenzfläche von Luft und Medium, gebildete Biofilm aktiver Phenazine produziert als die planktonischen Zellen. Auf Grundlage der Daten ist anzunehmen, dass nur ein geringer Anteil dieser Phenazinmoleküle in das darunterliegende Medium diffundiert, wo sie aktiv zur Stromproduktion beitragen. Der indirekte Elektronentransfer mittels redoxaktiver Phenazine in einem BES setzt mehrere Reduktions- und Oxidationszyklen der individuellen Mediatormoleküle voraus. Über die Reduktion von Phenazinen durch P. aeruginosa in vivo ist bislang jedoch nur wenig bekannt. In dieser Arbeit konnten potentielle Enzyme identifiziert werden, die eine unspezifische in vivo Reduktion der Phenazine gegebenenfalls katalysieren. Zudem wird eine Begründung für die schnellere Umsetzung der Kohlenstoffquelle 2,3-BD, bei gleichzeitiger erhöhter Katabolitenrepression, im Vergleich zu Glucose aufgezeigt.

The ubiquitously distributed Pseudomonas aeruginosa is able to generate electrical current in a bioelectrochemical system (BES). Here, the transmission of electrons from the cell to the anode is facilitated by self-produced redox active mediators, known as phenazines. These colored compounds are one of the hallmarks of P. aeruginosa and, if a sufficient concentration is reached, can be spotted by the naked eye on plates and in liquid cultures. During strain maintenance of the PA14 strain, individual colonies exhibiting strongly reduced levels of excreted phenazines were found. Depending on which carbon source was used, the isolate also showed a substantially altered time profile of, or overall decrease in phenazine production and current generation. Re-sequencing of the two colony forms verified a two base pair deletion in the LasR encoding gene, for the less phenazine producing variant. LasR is the master regulator of the complex quorum sensing (QS) system, regulating the expression of a myriad of different genes by direct and indirect means. Among these targets are the phenazine biosynthesis operons. This study proved that it is possible to correlate the carbon source dependent current generation of P. aeruginosa to the lasR gene and suggests a signaling link between 2,3-butanediol (2,3-BD) and the QS regulatory system in a lasR dependent manner. Besides the used carbon source, also the used strain of P. aeruginosa has proven to be of vast importance for its ability to facilitate current production in a BES. To help to understand what makes the natural BES isolate KRP1 a supreme candidate for further microbial fuel cell developments, its genome was de novo sequenced and analyzed in detail. Thereby it could be shown that KRP1 clearly is a P. aeruginosa variant, a relationship that was ambiguous before. Additionally, the overall genome organization of KRP1 was analyzed for the existence of genomic islands, hence islands of genes that are not shared by all members of the P. aeruginosa species. By the use of multiple software programs, 18 such regions could be determined, which sum up to about 10% of the whole genome. Many of the detected islands have been, in parts, reported in other P. aeruginosa strains. In this respect, KRP1 contains all genomic islands previously recognized in the highly virulent PSE9 variant and many of the islands responsible for increased virulence of the Liverpool Epidemic Strain (LES). This prompts the conclusion that the BES isolate KRP1 most likely is a highly virulent P. aeruginosa strain. The genome sequences of PA14 and KRP1, generated in this thesis, laid an ideal foundation to deeper investigate the regulatory networks causing the reported strain- and carbon source dependent current generation of P. aeruginosa in a BES. A whole-transcriptomic approach was chosen to generate a, as comprehensive as possible, connected picture of all intertwined pathways. To this end, individual RNA sequencing was performed for PA14 and KRP1 planktonic and biofilm cells, originating from a 2,3-BD- or glucose fed BES reactor. By generating individual libraries for each strain, subpopulation and carbon source, distinct differential gene expression analysis sets were possible in order to separate carbon source triggered alterations from changes caused by the different lifestyles. The transcriptional data of this study show that the biofilm subpopulation, formed at the medium-air interface on top of the reactor, is more active in phenazine production than the planktonic cells. Presumably, only a small fraction of the phenazine molecules diffuse into the media where they can actively be used for current generation. Indirect electron transfer with redox active phenazines requires multiple reduction and oxidation cycles of individual mediator molecules, but information about in vivo phenazine reduction in P. aeruginosa has been scarce. This study identified potential target enzymes that might facilitate unspecific phenazine reduction in vivo and explains why the carbon source 2,3-BD is reported to be utilized more rapidly than glucose, while at the same time experiencing greater catabolite repression than the hexose. Taken all results together, the individual investigations performed in the scope of this thesis help to understand the carbon source dependent bioelectrochemical activity of Pseudomonas aeruginosa strains.

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