Integrated biochemical engineering : strain and process engineering for the production of rhamnolipids

Demling, Philipp; Jupke, Andreas; Blank, Lars M.

doi:10.18154/RWTH-2021-11240

Integrated biochemical engineering : strain and process engineering for the production of rhamnolipids = Integrierte Stamm- und Prozessentwicklung am Beispiel der rekombinanten Rhamnolipidproduktion

Demling, Philipp^RWTH*

2021 & 2022

VerantwortlichkeitsangabePhilipp Demling

Ausgabe1. Auflage

ImpressumAachen : Apprimus Verlag 2021

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

ISBN978-3-98555-005-0

ReiheApplied microbiology ; 25

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Druckversion: 2021. - Auch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2022

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH* ; Jupke, Andreas (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2021-08-09

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2021-11240
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/836330/files/836330.pdf

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Projekte

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Pseudomonas putida (frei) ; in situ liquid-liquid extraction (frei) ; integrated bioprocess engineering (frei) ; multiphase loop reactor (frei) ; rhamnolipids (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Um biotechnologischer Prozesse im Zuge der angestrebten zirkulären Bioökonomie zu etablieren, müssen ganzheitliche Ansätze verfolgt werden, die alle Stufen der Prozessentwicklung integriert. In diesem Rahmen veranschaulicht die vorgestellte Arbeit die Integration von Stamm- und Prozessentwicklung am Beispiel der Produktion der Biotensid-Klasse der Rhamnolipide mit rekombinantem Pseudomonas putida KT2440. Starke Schaumbildung hindert die Prozessführung für die Produktion von Biotensiden in Bioreaktoren. Um diese Herausforderung zu umgehen, wurde eine in situ flüssig-flüssig-Extraktion etabliert, wofür ein geeignetes biokompatibles Lösungsmittel in einer mehrstufigen Auswahlstrategie identifiziert wurde. Diese Strategie schloss die weitere Produktrückgewinnung und das Lösungsmittelrecycling mit ein. Um die Funktionalität der Extraktion zu verbessern, wurden Kultivierungsparameter angepasst, was wiederum die Leistung des Ganzzell-Biokatalysators beeinflusste. Das Aufdecken von Wechselwirkungen der integrierten Up- und Downstream-Prozessschritte führte zur Definition eines Betriebsfensters, das eine schaumfreie Fed-Batch-Kultivierung von Rhamnolipid-produzierendem P. putida KT2440 mit integrierter in situ Extraktion erlaubte. Anschließend wurden verschiedene Kultivierungsmodi für eine gesteigerte Produktion evaluiert und Strategien für eine verbesserte Phasentrennung erarbeitet. Da die Grenzen des Betriebsfensters durch den Ganzzell-Biokatalysator limitiert sind, wurden Methoden der Stammentwicklung genutzt, um die Lösungsmitteltoleranz von P. putida KT2440 zu erhöhen und damit die Verwendung zusätzlicher Extraktionsmittel zu ermöglichen. Hier wurde P. putida KT2440 erfolgreich dahingehend angepasst, hohe Konzentrationen von 1-Oktanol zu tolerieren. Nach Genom-Resequenzierung und anschließendem Reverse Genome Engineering wurden Stämme erzeugt, die Rhamnolipid-Produktion in der Gegenwart von 1-Oktanol ermöglichen. Des Weiteren wurde gezeigt, dass P. putida KT2440 vorübergehende, sich jedoch wiederholende Sauerstofflimitierungen überstehen kann, ohne dabei an Produktionskapazität einzubüßen. Dies unterstreicht seine herausragende Eignung für Produktionsprozesse im industriellen Maßstab. Die erhobenen Erkenntnisse wurden verwendet, um ein Betriebsfenster für die Produktion von Rhamnolipiden in einem speziell entwickelten Mehrphasen-Schlaufenreaktor zu definieren, der die Kultivierung mit einer in situ flüssig-flüssig-Extraktion im Gegenstrom integriert. Die Leistungsindikatoren der durchgeführten Kultivierung waren vergleichbar mit denen der zweiphasigen Kultivierungen in Rührkesselreaktoren, was die Robustheit von P. putida KT2440 als Ganzzell-Biokatalysatoren unterstreicht und als Machbarkeitsnachweis für den neuartigen Reaktor dient. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit Aspekte der integrierten Bioprozessentwicklung und die Dringlichkeit einer ganzheitlichen, interdisziplinären Betrachtung für die gesamte Prozessentwicklung auf. Obwohl sich die Ergebnisse dieser Arbeit spezifisch auf das vorgestellte System zur Herstellung von Rhamnolipiden mit rekombinantem P. putida KT2440 beziehen, können die grundlegenden Konzepte und vorgeschlagenen Lösungsansätze auf andere Bioprozesse übertragen werden. Dadurch wird die Entwicklung kompetitiver, industrieller Bioprozesse gefördert, die schlussendlich zur Etablierung der angestrebten zirkulären Bioökonomie beitragen.

Establishing biotechnological processes within the envisaged circular bioeconomy requires holistic approaches including an integration of all stages of process development. In this scope, the presented thesis illustrates the integration of strain and process engineering using the example of producing the biosurfactant rhamnolipids with recombinant Pseudomonas putida KT2440. A process-hindering challenge during the production of biosurfactants in aerated bioreactors is excessive foaming. To mitigate this challenge, an in situ liquid-liquid extraction was established by selecting a suitable, biocompatible extraction solvent in a multi-step strategy, including the assessment of product recovery and solvent recycling. A refinement of cultivation parameters was required to enhance functionality of the extraction, in turn influencing the performance of the whole-cell biocatalyst. Unraveling interactions of integrated up- and downstream processing resulted in the definition of a joint operational window. Finally, a foam-free fed-batch cultivation of rhamnolipid-producing P. putida KT2440 with integrated in situ extraction was established. Subsequently, different cultivation modes have been evaluated for enhanced production, and strategies for improved phase separation have been explored. As the microbial boundaries of the operational window are restricting process performance, host engineering was approached to enhance the solvent tolerance of P. putida KT2440, thereby enabling the utilization of additional extraction solvents. P. putida KT2440 was successfully adapted to tolerate high concentrations of 1-octanol. Genome re-sequencing and subsequent reverse genome engineering enabled the construction of tolerant strains capable of producing rhamnolipids in the presence of 1-octanol. Another challenge are transient oxygen limitations in industrial fermentations, which P. putida KT2440 masters well without losing production capacity, thereby highlighting its outstanding suitability for industrial-scale production processes. Previous findings were considered to define an operational window to produce rhamnolipids with recombinant P. putida KT2440 in a custom-designed multiphase loop reactor, integrating cultivation and an in situ counter-current liquid-liquid extraction. Performance indicators compared well with previous two-liquid phase cultivations in stirred-tank reactors, emphasizing the robustness of P. putida KT2440 and serving as a proof of concept for the novel reactor type. In conclusion, this thesis advocates integrated bioprocessing and the urgency for a holistic, interdisciplinary perspective on the overall process development. While the specific outcomes of this thesis are related to the presented system of producing rhamnolipids with recombinant P. putida KT2440, basic concepts and proposed solutions can be extrapolated to other challenging cases in bioprocess development. Thereby, competitive industrial bioprocesses are promoted, eventually contributing to establishing the envisaged circular bioeconomy.

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