Investigation of the effects of chinese herb medicine on TNF-[alpha] induced apoptosis in Huvec and Jurkat cells and their antioxidative effects

Zhou-Stache, Jingfang; Büttner, Reinhard

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-2860

Investigation of the effects of chinese herb medicine on TNF-[alpha] induced apoptosis in Huvec and Jurkat cells and their antioxidative effects

Zhou-Stache, Jingfang (Author)

2002

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Jingfang Zhou-Stache geb. Zhou

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2002

UmfangIII, 84 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2002

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Büttner, Reinhard (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2002-02-08

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-2860
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/56880/files/Zhou-Stache_Jingfang.pdf

Einrichtungen

Medizinische Fakultät (510000-1)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Medizin (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Das in der traditionellen chinesischen Madison verwendete Extrakt Radix Salviae Miltiorrhizae (RSM) wird zur Behandlung von Herzkreislauf und zerebrovaskulären Krankheiten benutzt. Einige Bestandteile des Pflanzenextraktes von Salviae Mitorrhiza Bunge sind bereits extrahiert und analysiert worden. Zwei dieser Komponenten sind Protocatechuic Säure (PAC) und Protocatechuic Aldehyd (PAL). Es wird angenommen, daß anti-apoptotische Therapien die Gewebeschäden bei Herzgefäßkrankheiten sowie zerebrovaskulären Krankheiten reduzieren. In dieser Arbeit wurde daher die zellprotektive Wirkung von PAC und PAL, im besonderen Hinblick auf Apoptose, untersucht. XTT-Assays wurden verwendet, um den Prozentsatz lebender Zellen unter verschiedenen Bedingungen quantitativ zu bestimmen. Menschliche Nabelschnur Endothelzellen sowie Jurkat Zellen wurden 2 Stunden mit PAC (100 µM) bzw. PAL (1 mM) inkubiert. Es konnte gezeigt werden, daß PAC und PAL die TNF-alpha induzierte Apoptose von menschlichen Nabelschnur Endothelzellen (Huvec) und Jurkat Zellen reduziert. Um molekulare Effekte auf die zelluläre Signaltransduktion zu untersuchen, wurden NF-kappaB Reportergen und DNA Bindungsaktivitäten mittels Luciferase Assays sowie Gel Shift Assays bestimmt. Die Degradation von IkBa wurde durch Western Blotts untersucht. Die molekularen Studien zeigten, daß NF-kappaB durch PAC aktiviert wurde. Der maximalen Effekt trat nach 30-minütiger Vorbehandlung der Zellen mit PAC auf. Hemmung der NF-kappaB Aktivität durch MG132 und ein NF-kappaB hemmendes Peptid unterdrückten den anti-apoptotischen Effekt von PAC. Weiterhin trat eine Degradation von IkBalpha infolge der Behandlung mit PAC auf. Unsere Ergebnisse liefern Hinweise darauf, daß die Aktivierung von NF-kappaB bei der anti-apoptotischen Wirkung von PAC auf Huvec und Jurkat Zellen eine wichtige Rolle spielt. Allerdings wurde die protektive Wirkung von PAL gegen Apoptose nicht von MG132 beeinflusst. Auch induzierte PAL keinen Abbau von IkappaBalpha in den Zellen. Diese Resultate deuten darauf hin, daß die anti-apoptotische Wirkung von PAL durch andere molekulare Mechanismen als durch die Aktivierung von NF-kappaB vermittelt wird. Zusätzlich wurde ein computergesteuertes Flußkanalsystem zur Bestimmung zellulärer rheologischer Parameter (Elias-c -) verwendet, um die antioxidative Wirkung von chinesischen Naturheilmitteln zu untersuchen. Dabei interessierten uns die Effekte der Kräuterextrakte sowie einiger ihrer Bestandteile auf die durch oxidative Schädigung veränderten rheologischen Parameter der Zellen. Als Parameter wurde die Steifigkeit und die Relaxationszeit roter Blutkörperchen (RBC) sowie die durch oxidative Schädigung (H2O2, 2 mM) induzierte Adhäsion von roten Blutkörperchen Endothelzellen gemessen. Nach Inkubation der roten Blutkörperchen mit H2O2 (20 min), zeigten die Zellen eine signifikant höhere Steifigkeit. Weiterhin war die Relaxationszeit im Vergleich zu Kontrollversuchen reduziert. Diese Änderungen der rheologischen Parameter waren irreversibel, nachdem die oxidativ geschädigten RBCs in Hepes Puffer reinkubiert wurden. Wurden die Zellen jedoch in Puffer mit 88.5 µM Tetramethylpyrazine (TMP) reinkubiert, ging die Änderung der Relaxationszeit auf das Niveau der Kontrolle zurück, während sich kein Effekt auf die Steifheit der Zellen zeigte. Als möglichen Mechanismus nehmen wir an, daß TMP die durch Wasserstoffperoxid verursachte Bildung von Spektrin-Hömoglobin-Komplexen teilweise aufhebt, was möglicherweise zu einer Normalisierung der Membranviskosität führen könnte. In den RBC-EC Adhäsionstests wurde eine maximale (über dreifache verglichen mit der Kontrolle) Zunahme der Adhäsion, bei mit H2O2 behandelten roten Blutzellen und Endothelzellen festgestellt. Diese Adhäsion wurde fast vollständig durch 50 µM 3,4-dihydroxyphenyl lactate (Dhpl) inhibiert, wenn diese Komponente entweder vor oder nach der Behandlung der Zellen mit H2O2 zugegeben wurde. Der Mechanismus dieser protektiven Wirkung könnte teilweise einem Effekt von Dhpl als Radikalfänger von in der Zellmembran gelösten Oxidantien zugeschrieben werden. Von einem methodischen Gesichtspunkt aus kann der Elias-c im Verbindung mit bestimmten Zellenarten und experimentellen Designs als zellulärer Bioassay verwendet werden, um die Wirkung von Kräuterextrakten mit hoher Effizienz im Labor zu prüfen.

The Chinese herb, Radix Salviae Miltiorrhizae (RSM), is being used in traditional Chinese medicine as a treatment for cardiovascular and cerebrovascular diseases. Several components of the plant extract from Salvia Mitorrhiza Bunge have been determined previously, two of which are protocatechuic acid (PAC) and protocatechuic aldehyde (PAL). Since anti-apoptotic therapies have been proposed to limit tissue damage in cardiovascular and cerebrovascular diseases, PAC and PAL effects on cell protection from apoptosis were investigated in this thesis. XTT assays were first used to quantify cell viability. We found that PAC and PAL inhibited TNF-alpha induced apoptosis of human umbilical vein endothelial cells (Huvec) and Jurkat cells in a concentration of 100 µM and 1mM respectively, when applied 2 hours prior to TNF-alpha exposition. To investigate molecular consequences on cellular signal transduction pathways, NF-kappaB reporter gene and DNA binding activities were investigated by luciferase assay and gel shift assay. Degradation of IkBalpha was determined by western blotting. The molecular studies revealed that PAC activated NF-kappaB with a maximal effect after 30 min of treatment. Inhibition of NF-kappaB action by MG132 and NF-kappaB inhibitory peptide suppressed the anti-apoptotic effect of PAC. Further, degradation of IkBalpha occurred in response to PAC treatment. Our results provide evidence that activation of NF-kappaB plays an important role in mediating the anti-apoptotic effect of PAC on HUVEC and Jurkat cells. Nevertheless, PAL protection from apoptosis triggered by TNF-alpha could not prevented by the treatment of MG132. Additionally, PAL did not induce IkappaBalpha degradation. The results implied that the anti-apoptotic action of PAL may be mediated by a molecular mechanism other than activation of NF-kappaB. In addition, a computer controlled flow channel system (Elias-c-) was tested in this thesis to study antioxidative capacities of herbal medicine. Effects of herbal extracts and single components on oxidatively impaired red blood cell (RBC) stiffness and relaxation time as well as on oxidative damage (H2O2, 2 mM) induced RBC-endothelial cell (EC) adhesion were investigated. Following H2O2 treatment (20 min), RBC became significantly stiffer and the relaxation time was reduced as compared with control. These changes were irreversible after re-incubating oxidatively damaged RBC in HEPES buffer. However, when oxidatively damaged RBC were re-incubated with 88.5 µM Tetramethylpyrazine (TMP), the H2O2-induced reduction in relaxation time turned back to control levels whereas the RBC stiffening did not. As mechanism we hypothesize, that TMP applied to hydrogen peroxide damaged RBC may partially reverse the hydrogen peroxide mediated formation of hemoglobin-spectrin complexes possibly leading to a normalization of the membrane viscosity. In the RBC-EC adhesion tests, a maximum (about three-fold as compared to control) increase in RBC-EC adhesion was obtained when both RBC and EC were treated with H2O2. This increase in adhesion was almost completely inhibited by 50 µM 3,4-dihydroxyphenyl lactate (Dhpl), when applied either prior to or after treatment with H2O2. The mechanism of the protection may be addressed in part to a direct free radical scavenging effect of antioxidants dissolved in the EC membrane. From a methodological point of view, the Elias-c in combination with appropriate cell types and experimental designs can be seen as a cellular bioassays to test herbal extracts with high laboratory efficacy.

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