Funktionale Charakterisierung sexualstadienspezifischer Proteine während der Gametogenese des humanpathogenen Malariaerregers Plasmodium falciparum

Bennink, Sandra; Spehr, Marc; Pradel, Gabriele

doi:HT020072923

Funktionale Charakterisierung sexualstadienspezifischer Proteine während der Gametogenese des humanpathogenen Malariaerregers Plasmodium falciparum

Bennink, Sandra^RWTH*

2019

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Sandra Bennink, M. Sc.

ImpressumAachen 2019

Umfang1 Online-Ressource (iv, 189 Seiten) : Illustrationen, Karten

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Pradel, Gabriele (Thesis advisor)^RWTH* ; Spehr, Marc (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2019-05-07

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2019-04776
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/761344/files/761344.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Infektionsbiologie (frei) ; Malaria (frei) ; Tropenkrankheit (frei) ; tropical disease (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Sexualphase des Malariaerregers Plasmodium falciparum, die durch die Bildung von intraerythrozytären Gametozyten im menschlichen Wirt eingeleitet wird, ist essentiell für die erfolgreiche Transmission des Parasiten. Das Ziel dieser Arbeit war die detaillierte Beschreibung verschiedener molekularer und zellulärer Mechanismen während der Sexualphase von P. falciparum und die Entschlüsselung der Rolle daran beteiligter Proteine. Als Vorbereitung für den Wirtswechsel speichern die Gametozyten Transkripte, die für Proteine kodieren, welche in den folgenden Mückenstadien benötigt werden, in Stressgranula und reprimieren ihre Translation. Nach der Transmission auf die Mücke wird die Repression während der Gametogenese aufgehoben und die entsprechenden Proteine synthetisiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte dem Protein 7-Helix-1 eine entscheidende Bedeutung an diesem Prozess zugesprochen werden. Durch die Detailanalyse von Transkriptomstudien einer 7-Helix-1-KO-Linie konnte gezeigt werden, dass der Verlust von 7-Helix-1 zu einer Deregulation Translations-assoziierter Gene führt. Das Protein konnte durch Co-Lokalisationsstudien und Western-Blot-Analysen als Bestandteil von Stressgranula identifiziert werden. Mittels Co-Immunpräzipitationen konnte 7-Helix-1 außerdem als Interaktionspartner bekannter translationaler Repressoren verifiziert und eine Bindung von reprimierten Transkripten an den Proteinkomplex gezeigt werden. Dementsprechend weisen 7-Helix-1-KO-Gametozyten eine verringerte Proteinbiosynthese der reprimierten Transkripte auf, was für eine Rolle von 7-Helix-1 in der Re-Initiation der Translation spricht. Während der Gametogenese muss der Parasit zudem aus dem Wirtserythrozyten ausbrechen, um den physischen Kontakt männlicher und weiblicher Gameten für die Fertilisation zu ermöglichen. Der Wirtszellaustritt geht unter anderem mit der Fusion von Zellaustrittsvesikeln mit der Plasmamembran einher, wobei beispielsweise das Perforin-ähnliche Protein PPLP2 in die Wirtszelle entlassen wird. Zur Identifikation des Proteoms dieser Vesikel wurde in der vorliegenden Arbeit eine PPLP2-BirA-Linie generiert, die zur BioID-basierten Identifikation der Interaktionspartnern von PPLP2 genutzt werden kann. Zur Untersuchung der Vesikelfusion und daran beteiligter Proteine erfolgte außerdem eine Expressionsanalyse verschiedener SNARE-Proteine mittels RT-PCR und IFA. Dabei konnten sowohl stadienunspezifische als auch Gametozyten-spezifische Vertreter dieser Proteinfamilie identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen während der Sexualphase des Malariaerregers P. falciparum bei und können für die Entwicklung neuer Medikamente genutzt werden.

The sexual reproduction phase of Plasmodium falciparum is essential for the successful transmission of the malaria parasite and represents an optimal target for transmission blocking intervention strategies. It is initiated by the formation of intra erythrocytic gametocytes in the human host. The aim of this thesis was to decipher different molecular and cellular processes during the sexual reproduction phase of P. falciparum and to describe the roles of proteins involved in these processes. In order to pre-adapt to the change of hosts, the parasite stores transcripts coding for proteins needed in the mosquito midgut stages in stress granules of female gametocytes thereby stalling translation. After transmission to the mosquito the translational repression is released during gametogenesis and protein synthesis is initiated. In the present thesis, the protein 7-Helix-1 was shown to play a crucial role in this process. The detailed analysis of transcriptome studies performed in a 7-Helix-1-deficient parasite line indicated that the loss of 7-Helix-1 results in a deregulation of translation associated genes. Via co-localization studies and Western blots, 7-Helix-1 was shown to be a component of stress granules. Co-immunoprecipitations verified 7-Helix-1 as an interaction partner of serveral known translational repressors and unveiled the binding of repressed transcripts to the complex. In accordance with these data, it was shown that the protein synthesis of repressed transcripts is reduced in 7-Helix-1-KO gametocytes, pointing to a role of 7-Helix-1 in the re-initiation of translation after the release of translational repression. Furthermore, the parasite has to egress from the enveloping red blood cell during gametogenesis in order to facilitate physical contact of the male and female gametes. The host cell egress is among others accompanied by the fusion of egress vesicles, that contain for example the perforin-like protein PPLP2, with the plasmamembrane and the secretion of their content into the host cytosol. To identify the proteome of the egress vesicles, a PPLP2-BirA parasite line has been generated, that will be employed in BioID-based approaches in order to decipher interaction partners of PPLP2. To further analyse the process of vesicle fusion and proteins involved in this exocytotic process, an expression analysis of putative SNARE proteins, that usually mediate vesicle fusion, has been performed using RT-PCR and IFA. The results revealed both stage unspecific and gametocyte specific members of the SNARE protein family. The results of this thesis contribute to the understanding of the molecular mechanisms during the sexual reproduction phase of the malaria parasite P. falciparum and can serve as a basis for the discovery of new drug and vaccine targets.

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