Cultivation systems for anaerobic single and mixed cultures

Keitel, Laura; Büchs, Jochen; Basen, Mirko

doi:10.18154/RWTH-2024-03782

Cultivation systems for anaerobic single and mixed cultures = Kultivierungssysteme für anaerobe Einzel- und Mischkulturen

Keitel, Laura^RWTH*

2024

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Laura Keitel

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2024

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2024

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Büchs, Jochen (Thesis advisor)^RWTH* ; Basen, Mirko (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2024-03-08

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2024-03782
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/983941/files/983941.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (416510)

Projekte

BMBF 031B0846B - Mikrobielle Biofabriken: BaPro - Darmbakterien des Phylums Bacteroidetes zur Herstellung von Probiotika, bioaktiven Substanzen und organischen Säuren aus nachwachsenden Rohstoffen (Teilprojekt B) (031B0846B) (031B0846B)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Der vielversprechende, kaum erforschte anaerobe Stamm Phocaeicola vulgatus (früher Bacteroides vulgatus) spielt eine wichtige Rolle für die Darmgesundheit und ist ein effektiver Produzent der industriell relevanten Säure Succinat. Ein detailliertes Verständnis des Stoffwechsels von P. vulgatus ist erforderlich, um die Succinatproduktion zu verbessern. Derzeit wird P. vulgatus meist in Mischkulturen erforscht, da dies seinem natürlichen Vorkommen entspricht. In dieser Arbeit wurden Reinkulturen in der Mikrotiterplatte, dem Schüttelkolben und einem 2-Liter-Fermenter untersucht. Zuerst wurde der Einfluss des initialen pH-Werts, der Pufferkonzentration, der Osmolalität, der Produktinhibition erforscht. Im zweiten Schritt wurden verschiedene CO2- und O2-Konzentrationen getestet. Im dritten Schritt wurde der Einfluss der initialen Glukose- und NH4Cl-Konzentration und verschiedener Kohlenstoff- und Stickstoffquellen charakterisiert. Die Kulturen wurden in mehreren am Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik entwickelten Geräten zur anaeroben Online-Überwachung von Fluoreszenz und Streulicht (BioLector) im Mikrotiterplattenmaßstab, im Fermenter mit online Gasmessung, und einem System zur Überwachung der Atmungsaktivität (RAMOS) im Schüttelkolbenmaßstab durchgeführt, welches die Online-Überwachung von CO2, O2 und Druck unter Begasung ermöglicht. Mittels HPLC-Analyse wurden geschlossene Kohlenstoffbilanzen im Schüttelkolben- und Fermentermaßstab erstellt. Die Gesamtgas- und die CO2-Transferraten ergaben, dass 65 % des produzierten Gases auf H2 und nur 35 % auf die CO2-Produktion zurückzuführen waren. Eine minimale Pufferkonzentration von 50 mM MOPS und ein initialer pH-Wert von 7,3 wurden festgelegt, um die pH-Inhibition bei der Kultivierung von P. vulgatus zu verringern. Die anfängliche Zugabe von Laktat zeigte eine hemmende Wirkung, beginnend bei einer Konzentration von 1 g L-1. Im Gegensatz dazu war die anfängliche Zugabe von Acetat förderlich für die Produktion organischer Säuren. Ein Vergleich zwischen einer pH-gepufferten und einer pH-kontrollierten 2-L-Fermentation zeigte eine Umstellung der Säureproduktion auf Succinat unter pH-Kontrolle. So erhöhte die pH-Kontrolle die Succinatproduktion von 0,05 g L-1 h-1 im Schüttelkolben auf 0,12 g L-1 h-1 Succinat im 2-L-Fermenter. Die Änderung der CO2-Konzentration in der Gaszufuhr ergab ein CO2-Optimum von 3,0 vol% für die gesamte organische Säureproduktion und 15,0 vol% für die Succinatproduktion. Es wurde nachgewiesen, dass sich die Zusammensetzung der organischen Säuren in Abhängigkeit von der CO2-Konzentration veränderte. Außerdem wurde ein uneingeschränktes Wachstum von P. vulgatus bis zu einer O2-Konzentration von 0,7 vol% in der Gasversorgung nachgewiesen. Bei Konzentrationen von größer gleich 1,3 vol% O2 nahm die Lebensfähigkeit ab. Die Ergebnisse zeigten ferner, dass die höchsten Succinatausbeuten im Minimalmedium mit 8 g L-1 anfänglicher Glukose, niedrigen Osmolalitäten und 0,25 g L-1 NH4Cl erreicht wurden. Die Succinatausbeute war jedoch noch höher, wenn Maltose und Laktose als Kohlenstoffquelle verwendet wurden. Die Zusammensetzung der organischen Säuren änderte sich bei wechselnden Kohlenstoff- und Stickstoffquellen. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit eine Mikrotiterplatte, die so genannte Link-Plate, entwickelt, mit der zwei durch eine Membran räumlich getrennte Stämme unter Mischkulturbedingungen kultiviert werden können, was eine stammaufgelöste Offline- und Online-Analytik ermöglicht. Die Online-Analytik erfolgte mit dem BioLector und einem System zur Überwachung der Atmungsaktivität im Mikro(μ)titerplatten-Maßstab (µRAMOS). In den Link-Plate-Experimenten konnten die OTR und das Streulicht nach Stamm aufgelöst in einem Ko-Kultivierungsexperiment bestimmt werden. Allerdings gibt es noch Herausforderungen im Herstellungsprozess zu überwinden.

The promising, yet barely investigated anaerobic strain Phocaeicola vulgatus (formerly Bacteroides vulgatus) plays a vital role for human gut health and effectively produces the industrially relevant acid succinate. Cultivating anaerobic bacteria is challenging, and a detailed understanding of P. vulgatus growth and metabolism is required to improve succinate production. Currently, P. vulgatus is mainly studied in mixed cultures, as it is its natural occurrence. In this work, axenic cultures were studied in microtiter plate, shake flask, and 2 L fermenter scales. First, the influence of initial pH, buffer concentration, osmolality, product inhibition was characterized. Second, the influence of different CO2 and O2 concentrations was tested. Third, the effect of initial glucose and NH4Cl concentration and different carbon and nitrogen sources on growth and organic acid production by P. vulgatus were examined. Cultivations were performed in an in-house built device for anaerobic online monitoring of fluorescence and scattered light (BioLector) in microtiter plate scale, a fermenter equipped with online gas monitoring and the in-house developed Respiratory Activity Monitoring System (RAMOS) in shake flask scale, which provides online monitoring of CO2, O2, and pressure under gassed conditions. HPLC analysis generated closed carbon balances in shake flask and fermenter scale, accounting for all produced acids. Total gas and CO2 transfer rates revealed that 65 % of produced gas was attributed to H2, while just 35 % was connected to CO2 production. A minimum buffer concentration of 50 mM MOPS and an initial pH of 7.3 were determined to reduce pH inhibition when cultivating P. vulgatus in a defined minimal medium and glucose as substrate. The initial addition of lactate showed an inhibitory effect, starting at a concentration of 1 g L-1. In contrast, the initial addition of acetate benefited organic acid production. A comparison between a pH-buffered and a pH-controlled 2-liter fermentation showed a switch in acid production to succinate under pH control. Thus, pH control increased succinate production from 0.05 g L-1 h-1 in the pH-uncontrolled shake flask to 0.12 g L-1 h-1 succinate in the 2-L fermenter. Changing the CO2 concentration in the gas supply revealed a CO2 optimum of 3.0 vol% for total organic acid production and 15.0 vol% for succinate production. It was demonstrated that the organic acid composition changed depending on the CO2 concentration. Furthermore, unrestricted growth of P. vulgatus up to an O2 concentration of 0.7 vol% in the gas supply was proven. The viability decreased rapidly at concentrations larger than or equal to 1.3 vol% O2. Results revealed that the highest succinate yields were reached with a standard media composition of 8 g L-1 initial glucose, low osmolalities, and 0.25 g L-1 NH4Cl. However, succinate yields were even higher when using maltose and lactose as carbon sources. The organic acid composition changed with changing carbon and nitrogen sources. Furthermore, a microtiter plate called Link-Plate, was developed in this work to co-cultivate two strains spatially separated by a membrane, making strain-resolved offline and online analysis possible. Online analysis was pursued by a BioLector and the in-house built micro(μ)-scale respiration activity monitoring system (µRAMOS). In the Link-Plate experiments, it was possible to determine the OTR and scattered light strain resolved in a co-cultivation experiment. However, there are still challenges to overcome in the manufacturing process.

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