Intrazelluläre Lokalisation und Targeting von ASIC4

Friedrich, Katharina; Müller-Newen, Gerhard; Gründer, Stefan

doi:urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-067117

Intrazelluläre Lokalisation und Targeting von ASIC4 = Intracellular localisation and targeting of ASIC4

Friedrich, Katharina

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Katharina Edeltraud Johanna Hedwig Friedrich

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (VII, 74 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Gründer, Stefan (Thesis advisor)^RWTH* ; Müller-Newen, Gerhard (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-07-07

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-067117
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/668346/files/668346.pdf
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/668346/files/668346.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Lehrstuhl für Physiologie (512000-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
ASIC (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Acid-sensing ion channels (ASICs) sind Protonen-sensitive, Spannungs-unabhängige und Amilorid-sensitive Natrium-Kanäle der DEG/ENaC-Genfamilie. ASIC4 ist ein Mitglied der ASIC-Familie, dessen mRNA im zentralen Nervensystem exprimiert wird. Die stärkste Lokalisation zeigt ASIC4-mRNA dort in der Hypophyse. Im Gegensatz zu anderen ASICs kann ASIC4 nicht durch Absenkung des pH-Werts aktiviert werden und zeigt mit 45% eine relativ geringe Sequenzübereinstimmung mit anderen ASICs, deren Sequenzen zu 50-65% übereinstimmen. Die Funktion des Kanals ist bisher unklar.In dieser Arbeit wurden die subzelluläre Lokalisation und das Targeting von ASIC4 untersucht. Nach transienter Transfektion von ASIC4 in den heterologen Zelllinien HEK293 und COS-7 ließ sich eine Akkumulation in vakuolen-ähnlichen Strukturen beobachten. Dies unterschied sich stark von dem retikulären Verteilungsmuster, das man üblicherweise bei anderen Mitgliedern der ASIC-Familie beobachten kann.Zur Identifizierung dieser vakuolären Lokalisation wurden die Zellen mit Antikörpern oder fluoreszierenden Organellmarkern gefärbt und mittels konfokaler Laserscanning - Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Dadurch konnte eine Ko-Lokalisation von ASIC4 und mRFP-Rab5, einem Marker für frühe Endosomen, festgestellt werden.Im nächsten Schritt wurde die Protein-Sequenz von ASIC4 auf Motive untersucht, die für die besondere Verteilung des Kanals in der Zelle verantwortlich sein könnten. ASIC4 besteht aus zwei Transmembrandomänen, einer extrazellulären Schleife und kurzen intrazellulären Amino- und Carboxy-Termini. Es wurden Chimären aus ASIC4 und jeweils dem Amino- oder dem Carboxy-Terminus von ASIC2a, einem Kanal mit einem retikulären Verteilungsmuster, hergestellt. Weiterhin wurden Punktmutationen von Di-Arginin- und Di-Leucin-Motiven, die bekannte Traffickingsignale sind, generiert und der Amino- und der Carboxy-Terminus schrittweise trunkiert. Sowohl der Amino-, als auch der Carboxy-Terminus stellten sich als wichtig für das Targeting von ASIC4 heraus. Die Amino- und Carboxy-terminalen Chimären zeigten ein retikuläres Verteilungsmuster, das dem Verteilungsmuster von ASIC2a ähnelte und eine Lokalisation im Endoplasmatischen Retikulum (ER) vermuten ließ. Die ersten 18 Aminosäuren des Amino-Terminus konnten als wichtiges Motiv für den anterograden Transport vom ER/Golgi zu frühen Endosomen identifiziert werden. Des Weiteren hat ein Di-Arginin-Motiv an Position 478/479 des Carboxy-Terminus eine wichtige Funktion für das Verbleiben von ASIC4 in frühen Endosomen. Mutiert man dieses Di-Arginin-Motiv, zeigt ASIC4 eine Ko-Lokalisation mit RFP-Rab7, einem Marker für späte Endosomen. Bei Trunkation des Carboxy-Terminus einschließlich des eben genannten Di-Arginin-Motivs wurde ASIC4 in ein weiteres Zellkompartiment dirigiert, welches als Lysosomen identifiziert werden konnte.Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit Traffickingsignale sowohl am Amino- als auch am Carboxy-Terminus von ASIC4 identifiziert werden, die für die Lokalisation von ASIC4 in frühen Endosomen verantwortlich sind. Somit kann vermutet werden, dass ASIC4 eine Rolle in diesem intrazellulären Kompartiment haben könnte und nicht an der Plasmamembran, wie es für andere Mitglieder der ASIC-Familie üblich ist.

Acid-sensing ion channels (ASICs) are proton-sensitive, voltage-independent and amiloride-sensitive sodium channels of the DEG/ENaC gene family. ASIC4 is a member of the ASIC family, and which mRNA is expressed in the central nervous system. The strongest localisation of ASIC4-mRNA is found in the pituitary gland. In contrast to other ASICs, ASIC4 can not be activated by protons. Furthermore, ASIC4 comprises only a rather low sequence identity with other ASICs of about 45%. In general, the sequence homology of ASIC1 – ASIC3 is in the range of 50 – 65%. The function of the channel is unknown until now.In this study the subcellular localisation and the targeting of ASIC4 were examined. After transient transfection of ASIC4 in the heterologous cell lines HEK293 and COS-7, an accumulation in vacuolar-like structures has been observed. This was strongly different to the reticular distribution pattern that is usually observed for other members oft he ASIC family.To identify this vacuolar localisation, cells were stained with antibodies or fluorescent organelle markers and were examined with confocal microscopy. Thereby, a co-localisation of ASIC4 and mRFP-Rab5, a marker for early endosomes, has been found.In the next step, the protein sequence was analysed to identify motives that could be responsible for the special distribution of ASIC4 in the cell. ASIC4 consists of two transmembrane domains, an extracellular loop and short intracellular amino- and carboxy-termini. Chimeras between ASIC4 and either the amino- or the carboxy-terminus of ASIC2a were constructed. ASIC2a, in contrast to ASIC4, is an ion channel with a reticular distribution pattern, Furthermore, point mutations of di-arginine- and di-leucine-motives, which are known as trafficking signals, were generated. In addition, the amino- and carboxy-termini of native ASIC4 were truncated step by step. The amino-terminus, as well as the carboxy-terminus could be identified as important for the targeting of ASIC4. The amino- and carboxy-terminal chimeras showed a reticular distribution pattern, similar to the distribution pattern of ASIC2a. This pattern suggested a localisation in the endoplasmatic reticulum (ER). The first 18 amino acids of the amino-terminus could be identified as important for the anterograde transport from ER/Golgi to early endosomes. Furthermore, a di-arginine-motif on position 478/479 of the carboxy-terminus has an important function for the retention of ASIC4 in early endosomes. By mutation of this di-arginine-motif, ASIC4 shows a co-localisation with RFP-Rab7, a marker for late endosomes. By truncation of the carboxy-terminus including the mentioned di-arginine-motif, ASIC4 was directed into another compartment of the cell, which could be identified as lysosomes.Taken together, this study could identify trafficking signals at the amino- as well as at the carboxy-terminus that are responsible for the localisation of ASIC4 in early endosomes. Thereby it can be suggested that ASIC4 could play a role in this intracellular compartment and not at the plasma membrane, as it is usual for other members of the ASIC family.

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